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人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》1.1 DNA重组技术的基本工具评课ppt课件
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这是一份人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》1.1 DNA重组技术的基本工具评课ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了选修3核心知识关系，现代生物科技专题，专题1基因工程，基因重组的广义理解，问题探讨，反向平行，SmaⅠ，黏性末端与配对，思考与探究P7等内容，欢迎下载使用。
目 录
专题1 基因工程专题2 细胞工程专题3 胚胎工程专题4 生物技术的安全性和伦理问题专题5 生态工程
基因工程细胞工程胚胎工程生态工程
生物技术的安全性与伦理问题
基因工程 细胞工程 胚胎工程 生态工程
各专题之间知识难度差异较大。
专题的安排是微观→中观→宏观。
本模块知识内容的构建顺序：
致同学们——《生物科技创造美好未来》 由领导和组织我国有关基因组测序工作的杨焕明教授撰写。给学生生物科学技术历史的凝重感和生物科学技术工作者的社会责任感以感染，而“生命是数据的”的提示，更洋溢着时代气息。
《基础理论和技术的发展催生了基因工程》《细胞工程的发展历程》《胚胎工程的建立》《生物技术引发的社会争论》《生态工程的兴起》
编写目的： 概述本领域的发展历程，激发学生的学习兴趣。 介绍一些背景资料或呈现一些不同的观点，以激发学生学习的兴趣。 加深学生对科学史和科学本质的理解和认识，增强学生对科学、技术与社会关系的理解。
1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导。
基础理论和技术发展催生了基因工程
20世纪中叶，基础理论取得了重大突破
2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。
1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.
1957年克里克提出中心法则的确立
3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.
1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明
1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.
1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯()细菌中发现了第一个限制酶
1977年科学家又发明了DNA序列分析方法
1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术
技术发明命使基因工程的实施成为可能
4) DNA体外重组的实现（5）重组DNA表达实验的成功
1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.
1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.
1980年第一个转基因小鼠问世
1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”
1983年培育出第一例转基因烟草
（6）第一例转基因动物问世
1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉
1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖
（7）PCR技术的发明
小结：基础理论和技术的发展催生了基因工程
DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明
1、基因拼接的理论基础：（1）DNA是生物的主要遗传物质。（2）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。（3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2、外源基因在受体内表达的理论基础：（1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。（2）遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。（3）生物界共用一套遗传密码。
本专题的内容由题图、《科技探索之路》和四节内容构成。
题图为学习者创设了一个意境。沃森和克里克对DNA双螺旋结构的重大发现和随后的技术创新孕育了基因工程。在复制的DNA双螺旋结构上展示的转基因工程菌、牛、羊、鱼、番茄、甜椒、牵牛等，代表了基因工程在三个重要方面的研究成果：转基因微生物、转基因动物和转基因植物。在上述画面的基础上，点出基因工程的主题：“基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”此题图不仅寓意深刻，且十分生动。
《科技探索之路-----基础理论和技术的发展催生了基因工程》是正文的前奏曲。没有基础理论的研究成果，没有技术方面的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。其内容分为两部分：一部分介绍基础理论研究成果，一部分介绍在技术层面上发明的各种操作手段。编者精选这些最重要的成果，其目的是使学生从科技史实中，感悟创新是科学技术发展的不竭动力。
20世纪中叶，基础理论取得了重大突破DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译
基础理论和技术的发展催生了基因工程:
基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
人类需要的新生物类型和产品
3、基因工程（人工DNA重组技术）
教学目标： 简述DNA重组技术所需要三种工具的作用； 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新教学重点： DNA重组技术所需要三种工具的作用教学难点： 基因工程载体需要具备的条件
1.1 DNA重组技术的基本工具
苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。
想一想：需要做哪些关键工作？
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
普通棉花(无抗虫特性)
②与运载体DNA拼接③导入
棉花细胞(含抗虫基因)
棉花植株(有抗虫特性)
上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？
基因工程的基本操作步骤:
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
从苏云金杆菌细胞内提取出抗虫基因
抗虫基因与运载体DNA拼接
抗虫基因导入受体(棉花)细胞
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
主要从原核生物中分离纯化出来。
已从近300种微生物中分离出约4000种限制酶。
1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
大肠杆菌（Escherichia cli R）
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
Ec RI限制酶的切割：
大肠杆菌的一种限制酶(Ec RⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
①识别GAATTC序列，②并在G和A之间切开
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
①识别CCCGGG序列，②并在G和C之间切开
限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
SmaI限制酶的切割：
切割DNA分子时产生的两种不同末端：
具有相同的黏性末端的碱基：
限制酶所识别的序列有什么特点？
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5、8个核苷酸组成。这些序列都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
要想获得某个特定性状的基因必须用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
切两个切口，产生四个黏性末端。
链状DNA（线性DNA）
要想获得某个特定性状的基因必须用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端。
用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？
现有一长度为1000碱基对(bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcR1酶切后得到的DNA分子仍是1000 bp，用Kpn1单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcRI、Kpnl同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是
原核生物中存在的限制酶有什么作用？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
原核生物中存在的限制酶为什么不切自身DNA？
思考：限制酶Mun I识别-C AATTG- 限制酶EcRI识别-G AATTC--
用限制酶Mun Ⅰ 切割质粒 用限制酶EcR Ⅰ切割含目的基因的DNA分子
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
E·cli DNA连接酶
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
DNA连接酶的缝合作用:
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶 或 T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
与DNA有关的酶的比较：
下图为三种限制酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和BglⅡ的识别序列及切点。它们切割出来的黏性末端可以互补配对的是：
GGATCCCCTAGG
AAGCTTTTCGAA
AGATCTTCTAGA
G CCTAG
GATCT A
GATCC G
A TCTAG
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1、假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？
导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。
2、作为载体没有切割位点将怎样？
3、目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？
如果载体上有遗传标记基因，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。
4、如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？
载体对受体有害，将影响受体细胞的新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。
载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。
将外源基因送入受体细胞。
质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等
裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
细菌中的DNA有两类：
1、并不是所有的细菌中都有质粒，
质粒的存在并不是细菌生长发育所必备的。
而质粒的存在赋予细菌特别额外的功能。
2、质粒并不是只有细菌细胞才有，酵母菌细胞内也有。
自然状况下，质粒只能侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制。但是在体外,若给予适宜的条件，质粒是可以复制的。
③作为载体的必要条件：
有切割位点——供外源DNA片段(基因)插入。能自我复制——并能带着插入的目的基因一起复制有遗传标记基因——供重组DNA的鉴定和选择。载体DNA必需是安全的——不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。载体DNA分子大小应适合——以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
在基因工程中使用的载体除了质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当与一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
（1）质粒是最常用的运载体，但载体并不全是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等载体。（2）并不是所有的质粒均合适作为载体，有很多质粒未必完全符合作为载体的条件。（如没有合适的标记基因等）。基因工程中所使用的质粒载体一般都是经过人工改造的。
主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键
E.cliDNA连接酶T4 DNA连接酶
结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个或多个限制酶切位点具标记基因
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
如果用同一种限制酶（EcRI酶）切割目的基因A和质粒B(小型环状DNA- - - 一般用作运载体)，让切割后的大量目的基因与切割后的大量质粒在DNA连接酶的作用后会有几种连接产物（注意：不考虑3个及以上的切割产物连接情况）？
1、应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，不能选目的基因内部的限制酶。
2、为避免目的基因及质粒自身的环化，也可以使用不同的限制酶切割目的基因及质粒。
3、不能切开质粒上所有的标记基因，至少要保留一个标记基因。
限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段： (1) …CTGCA (2) …AC (3) GC… …G …TG CG… （4）…G (5) G… (6) …GC …CTTAA ACGTC… …CG (7) GT… (8)AATTC… CA… G… 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
只要黏性末端能互补配对，就能形成重组DNA
据图分析，（1）和 （5）具有相同的黏性末端，则能连接形成；（2）和（7）具有相同的平末端，能连接形成 ；（3）和（6）具有相同的平末端，能连接形成；（4）和（8）具有相同的黏性末端，能连接形成．
① 不同的DNA分子用同种限制酶切割，形成的黏性末端都相同。
② 同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
③ 不同的限制酶切割产生的黏性末端，如果互补，则可以相互重新配对。
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
“Nem enim ipsam vluptatem quia vluptas sit aspernatur aut dit aut fugit”
下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
1、一个图1 所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有 个游离的磷酸基团
2、用图1 所示的质粒和图2的目的基因构建重组质粒，能不能用SmaⅠ切割？
不能，用SmaⅠ切割后，质粒没有标记基因了
3、防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcRⅠ。
4、为了获取重组质粒，最好用BamHⅠ 和Hind Ⅲ 同时切割质粒和外源DNA。
目 录
专题1 基因工程专题2 细胞工程专题3 胚胎工程专题4 生物技术的安全性和伦理问题专题5 生态工程
基因工程细胞工程胚胎工程生态工程
生物技术的安全性与伦理问题
基因工程 细胞工程 胚胎工程 生态工程
各专题之间知识难度差异较大。
专题的安排是微观→中观→宏观。
本模块知识内容的构建顺序：
致同学们——《生物科技创造美好未来》 由领导和组织我国有关基因组测序工作的杨焕明教授撰写。给学生生物科学技术历史的凝重感和生物科学技术工作者的社会责任感以感染，而“生命是数据的”的提示，更洋溢着时代气息。
《基础理论和技术的发展催生了基因工程》《细胞工程的发展历程》《胚胎工程的建立》《生物技术引发的社会争论》《生态工程的兴起》
编写目的： 概述本领域的发展历程，激发学生的学习兴趣。 介绍一些背景资料或呈现一些不同的观点，以激发学生学习的兴趣。 加深学生对科学史和科学本质的理解和认识，增强学生对科学、技术与社会关系的理解。
1.1944年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球菌体外转化实验,证明了DNA是生物的遗传物质,并且证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,成为基因工程的先导。
基础理论和技术发展催生了基因工程
20世纪中叶，基础理论取得了重大突破
2.1953年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型,使生物学进入分子水平。
1958年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术,用实验证明了DNA的复制是以半保留方式进行的.
1957年克里克提出中心法则的确立
3.1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破译编码氨基酸的遗传密码.
1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明
1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.
1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯()细菌中发现了第一个限制酶
1977年科学家又发明了DNA序列分析方法
1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术
技术发明命使基因工程的实施成为可能
4) DNA体外重组的实现（5）重组DNA表达实验的成功
1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.
1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.
1980年第一个转基因小鼠问世
1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”
1983年培育出第一例转基因烟草
（6）第一例转基因动物问世
1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉
1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖
（7）PCR技术的发明
小结：基础理论和技术的发展催生了基因工程
DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明
1、基因拼接的理论基础：（1）DNA是生物的主要遗传物质。（2）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。（3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2、外源基因在受体内表达的理论基础：（1）基因是控制生物性状的独立遗传单位。（2）遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。（3）生物界共用一套遗传密码。
本专题的内容由题图、《科技探索之路》和四节内容构成。
题图为学习者创设了一个意境。沃森和克里克对DNA双螺旋结构的重大发现和随后的技术创新孕育了基因工程。在复制的DNA双螺旋结构上展示的转基因工程菌、牛、羊、鱼、番茄、甜椒、牵牛等，代表了基因工程在三个重要方面的研究成果：转基因微生物、转基因动物和转基因植物。在上述画面的基础上，点出基因工程的主题：“基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”此题图不仅寓意深刻，且十分生动。
《科技探索之路-----基础理论和技术的发展催生了基因工程》是正文的前奏曲。没有基础理论的研究成果，没有技术方面的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。其内容分为两部分：一部分介绍基础理论研究成果，一部分介绍在技术层面上发明的各种操作手段。编者精选这些最重要的成果，其目的是使学生从科技史实中，感悟创新是科学技术发展的不竭动力。
20世纪中叶，基础理论取得了重大突破DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译
基础理论和技术的发展催生了基因工程:
基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
人类需要的新生物类型和产品
3、基因工程（人工DNA重组技术）
教学目标： 简述DNA重组技术所需要三种工具的作用； 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新教学重点： DNA重组技术所需要三种工具的作用教学难点： 基因工程载体需要具备的条件
1.1 DNA重组技术的基本工具
苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。
想一想：需要做哪些关键工作？
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
普通棉花(无抗虫特性)
②与运载体DNA拼接③导入
棉花细胞(含抗虫基因)
棉花植株(有抗虫特性)
上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？
基因工程的基本操作步骤:
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
“分子缝合针”—— DNA连接酶
“分子运输车”—— 基因进入受体细胞的载体
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
从苏云金杆菌细胞内提取出抗虫基因
抗虫基因与运载体DNA拼接
抗虫基因导入受体(棉花)细胞
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
主要从原核生物中分离纯化出来。
已从近300种微生物中分离出约4000种限制酶。
1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
大肠杆菌（Escherichia cli R）
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
Ec RI限制酶的切割：
大肠杆菌的一种限制酶(Ec RⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
①识别GAATTC序列，②并在G和A之间切开
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，可在切口处带有几个伸出的核苷酸，他们之间碱基正好互补配对，因此称这些片断为黏性末端。
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
①识别CCCGGG序列，②并在G和C之间切开
限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
SmaI限制酶的切割：
切割DNA分子时产生的两种不同末端：
具有相同的黏性末端的碱基：
限制酶所识别的序列有什么特点？
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4、5、8个核苷酸组成。这些序列都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
要想获得某个特定性状的基因必须用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
切两个切口，产生四个黏性末端。
链状DNA（线性DNA）
要想获得某个特定性状的基因必须用限制性核酸内切酶切几个切口？可产生几个黏性末端？
如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端。
用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？
现有一长度为1000碱基对(bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcR1酶切后得到的DNA分子仍是1000 bp，用Kpn1单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcRI、Kpnl同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是
原核生物中存在的限制酶有什么作用？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
原核生物中存在的限制酶为什么不切自身DNA？
思考：限制酶Mun I识别-C AATTG- 限制酶EcRI识别-G AATTC--
用限制酶Mun Ⅰ 切割质粒 用限制酶EcR Ⅰ切割含目的基因的DNA分子
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
E·cli DNA连接酶
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
DNA连接酶的缝合作用:
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶 或 T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
与DNA有关的酶的比较：
下图为三种限制酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和BglⅡ的识别序列及切点。它们切割出来的黏性末端可以互补配对的是：
GGATCCCCTAGG
AAGCTTTTCGAA
AGATCTTCTAGA
G CCTAG
GATCT A
GATCC G
A TCTAG
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1、假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？
导入受体细胞的目的基因不能复制，将在细胞增殖中丢失。
2、作为载体没有切割位点将怎样？
3、目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？
如果载体上有遗传标记基因，在载体进入受体细胞后，就可通过标记基因的表达来检测。
4、如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？
载体对受体有害，将影响受体细胞的新陈代谢，进而使转入的目的基因也无立足之地。载体不能分离，就不能获得更多带有目的基因的载体。
载体没有切割位点，外源的目的基因不可能插入。
将外源基因送入受体细胞。
质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等
裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
细菌中的DNA有两类：
1、并不是所有的细菌中都有质粒，
质粒的存在并不是细菌生长发育所必备的。
而质粒的存在赋予细菌特别额外的功能。
2、质粒并不是只有细菌细胞才有，酵母菌细胞内也有。
自然状况下，质粒只能侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制。但是在体外,若给予适宜的条件，质粒是可以复制的。
③作为载体的必要条件：
有切割位点——供外源DNA片段(基因)插入。能自我复制——并能带着插入的目的基因一起复制有遗传标记基因——供重组DNA的鉴定和选择。载体DNA必需是安全的——不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。载体DNA分子大小应适合——以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
在基因工程中使用的载体除了质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当与一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
（1）质粒是最常用的运载体，但载体并不全是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等载体。（2）并不是所有的质粒均合适作为载体，有很多质粒未必完全符合作为载体的条件。（如没有合适的标记基因等）。基因工程中所使用的质粒载体一般都是经过人工改造的。
主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键
E.cliDNA连接酶T4 DNA连接酶
结构简单,大小适中能在宿主细胞中自我复制并稳定存在具一个或多个限制酶切位点具标记基因
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
如果用同一种限制酶（EcRI酶）切割目的基因A和质粒B(小型环状DNA- - - 一般用作运载体)，让切割后的大量目的基因与切割后的大量质粒在DNA连接酶的作用后会有几种连接产物（注意：不考虑3个及以上的切割产物连接情况）？
1、应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，不能选目的基因内部的限制酶。
2、为避免目的基因及质粒自身的环化，也可以使用不同的限制酶切割目的基因及质粒。
3、不能切开质粒上所有的标记基因，至少要保留一个标记基因。
限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段： (1) …CTGCA (2) …AC (3) GC… …G …TG CG… （4）…G (5) G… (6) …GC …CTTAA ACGTC… …CG (7) GT… (8)AATTC… CA… G… 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？
只要黏性末端能互补配对，就能形成重组DNA
据图分析，（1）和 （5）具有相同的黏性末端，则能连接形成；（2）和（7）具有相同的平末端，能连接形成 ；（3）和（6）具有相同的平末端，能连接形成；（4）和（8）具有相同的黏性末端，能连接形成．
① 不同的DNA分子用同种限制酶切割，形成的黏性末端都相同。
② 同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
③ 不同的限制酶切割产生的黏性末端，如果互补，则可以相互重新配对。
2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？
提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。
“Nem enim ipsam vluptatem quia vluptas sit aspernatur aut dit aut fugit”
下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
1、一个图1 所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有 个游离的磷酸基团
2、用图1 所示的质粒和图2的目的基因构建重组质粒，能不能用SmaⅠ切割？
不能，用SmaⅠ切割后，质粒没有标记基因了
3、防止酶切后含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcRⅠ。
4、为了获取重组质粒，最好用BamHⅠ 和Hind Ⅲ 同时切割质粒和外源DNA。
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