生物选修1《生物技术实践》课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段图文课件ppt

这是一份生物选修1《生物技术实践》课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段图文课件ppt，共35页。PPT课件主要包含了4种脱氧核苷酸，DNA母链，解旋酶，DNA聚合酶，双螺旋，结合成双链，两条模板链，耐热的，缓冲溶液，90℃等内容，欢迎下载使用。

在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。
请思考：1．PCR技术的基本原理是什么？2．PCR反应过程是怎样的？
1．生物体内DNA复制的条件(1)原料：___________________________________________________。(2)模板：解旋后的每一条____________。(3)酶：打开DNA双链的________和合成DNA单链的____________。(4)引物：为DNA聚合酶的起始提供________末端。
一、PCR的原理及反应过程
2．PCR扩增的原理(1)概念：PCR即多聚酶链式反应，是一种体外________________的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)原理：①DNA变性：在__________的温度范围内，DNA的________结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。
迅速扩增DNA片段　
80 ～100 ℃　
②DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新____________，这个过程称为复性。③DNA合成：DNA聚合酶从引物____________端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的________端向________端延伸。
(3)条件：①模板：解旋后的每一条___________。②引物：能分别与____________结合的两种引物。③原料：____________________________________________________。④酶：________DNA聚合酶。⑤其他条件：需要稳定的__________和能自动调节温度的温控设备。
1．实验用具 (1)PCR仪：该仪器能自动调控________，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个________水浴锅代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。 (2)微量离心管：总容积为________mL，实际上是进行PCR反应的场所。 (3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。
3．DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在________的紫外线波段有一强烈的吸收峰。(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝__________________×稀释倍数。点拨：在PCR实验操作中，常用微量离心管作为反应场所，在操作时，用微量移液器按照PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。
50×(260 nm的读数)
一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较
①DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。②注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。③DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
例1标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是(　　)A．92 ℃、50 ℃、72 ℃　　B．72 ℃、50 ℃、92 ℃C．50 ℃、92 ℃、72 ℃ D．80 ℃、50 ℃、72 ℃
解析：当温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 ℃(70～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。答案：A
1．DNA的复制需要引物，其主要原因是(　　)A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助DNA聚合酶的延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
解析：：DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(－OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。答案：D
二、PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成：1．模板DNA的变性模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。2．模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3．引物的延伸DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为反应原料，DNA母链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—复性—延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 min,2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR扩增过程中的易错点①PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。②复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。
1．操作步骤(1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。(2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。(3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。(4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。
(5)将离心管放在PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。以上过程可以概括为准备、移液、混合、离心、反应五大步。
2．实验结果与分析(1)实验中DNA含量的测定。①稀释：取2 μL PCR反应液，加入98 μL蒸馏水，即将样品稀释了50倍。②对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。③测定：取DNA稀释液100 μL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值。④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
(2)理论上DNA扩增数目的计算。DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a×2n个DNA。(3)DNA扩增是否成功。检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。
例2下列操作过程的叙述中错误的是(　　)A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换
解析：从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。答案：C
2．在PCR实验操作中，下列说法不正确的是(　　)A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果
解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。答案：A