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高中生物浙科版选修1《生物技术概述》第一部分 微生物的利用实验1 大肠杆菌的培养和分离课文配套ppt课件
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这是一份高中生物浙科版选修1《生物技术概述》第一部分 微生物的利用实验1 大肠杆菌的培养和分离课文配套ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了一实验目的，二实验器材，超净台，高压蒸汽灭菌锅，二菌落，三培养基，微生物，微生物的概念，涂布分离法，二倒平板等内容，欢迎下载使用。
一.实验目的二.实验仪器三.微生物培养涉及的重要概念介绍四.实验步骤五.思考题
实验一 大肠杆菌的培养和分离
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平面培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理
三.微生物培养涉及的重要概念介绍
（一）大肠杆菌（E. cli）
（四）无菌操作技术
（五）主要实验过程
指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或无细胞结构的低等生物。
革兰氏______（填阴或阳）性菌
1.特点： P19-1
（大肠杆菌是肠道内的共生菌群，一般无害）
2.与人类关系：（P19---2）
有益：合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。有害：少数有害，可以侵染肠粘膜并产生毒素，任何大肠杆菌进 入人的泌尿系统都会有害
3.生活环境： 最适温度370C、最适pH值=7.0
4.用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具 P19-4
例如：①重组的人粒细胞——巨噬细胞集落刺激因子，是一种蛋白质，能 提高人的白细胞的含量，放疗、化疗必用辅助药物。 ②胰岛素——治疗糖尿病的药物
单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。(每一个细菌可产生一个菌落)
不同细菌的菌落的大小、形态、隆起、边缘、表面状况、质地、颜色、硬度、透明度等方面不同。
3.应用 菌落是鉴定菌种的重要依据。
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
①液体培养基： 不加入凝固剂，常用于扩大培养、工业生产
③固体培养基： 加入适量凝固剂，常用于菌种的分离、计数、 鉴定
②半固体培养基：加入少量凝固剂，常用于菌种保存、观察微 生物的运动
思考：动物细胞培养，植物组织培养分别用什么培养基？获得植物的原生质体用何种培养基？
①选择培养基：在普通培养基中添加或减少某种化学成分，允许特定微生物的生长，抑制不需要的微生生长。用于菌种的分离
例1：下列过程用到选择培养基的是________ A、获得抗盐、抗病的突变体植株 B、获得能利用尿素的细菌 C、获得杂交瘤细胞 D、获得含胰岛素基因的大肠杆菌
②鉴定培养基：在普通培养基中添加某种指示剂或化学药品，用于菌种的鉴定。
如：加酚红的以尿素为唯一氮源的培养基能鉴定是否有分解尿素的细菌以及分解尿素的能力
不同的微生物往往需要用不同的培养基配方，不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透压的要求．
（1）不同微生物需要的培养基中的营养物质不同
细菌喜荤（蛋白质） 霉菌喜素（糖类）
思考：LB培养基中提供碳源的是_____。提供氮源的是_____。NaCl的作用是_____。LB培养基能用来培养食用菌吗？______。
（2）不同微生物需要的PH不同
细菌 6.5-7.5 中性偏碱真菌 5.0-6.0 中性偏酸
（3）微生物需要的合适的温度
通常加入一定量的NaCl，来维持一定的渗透压
例题1：某一种细菌要从环境中提取现成的亮氨 酸（20种氨基酸中的一种） 才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。 根 据实验的目的，选用的培养基类型是（ ）
例2：不同培养基的具体配方不同，但一般都有 （ ） Ａ．氮源、磷酸盐和维生素 Ｂ．氮源和维生素 Ｃ．水、碳源、氮源和无机盐 Ｄ．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素例3．下列叙述正确的是 （ ） Ａ．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 Ｂ．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 Ｃ．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基 Ｄ．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染，获得纯净微生物的方法。
成功地培养微生物的关键
（1）灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。
①100℃煮沸5-6min②高猛酸钾、次氯酸钠（植物外植体）③用75%酒精擦拭④紫外线消毒（空气中）
①灼烧灭菌②干热灭菌③高压蒸汽灭菌④过滤灭菌
作用对象：①实验操作场所（酒精）②操作空间（紫外线）③操作者的衣和手（酒精）④活的实验材料等
作用对象：①培养基②微生物的培养器皿③操作工具等直接接触微生物的物体
①灼烧灭菌②高压蒸汽灭菌（P20-倒4）灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好1kg/cm2、121℃ 下维持15min.③过滤灭菌滤除直径1.5-0.6 μm的病菌④干热灭菌
①化学药剂消毒法: 用75%酒精、高猛酸钾、5%的次氯酸钠等消毒②紫外线消毒（空气）
操作空间（超净台） 75%酒精擦、紫外灯、过滤风
(1)操作空间要消毒：紫外线、过滤风。(P21—1)(2)操作场所(超净台)和实验者的手要消毒：用70%的酒精擦(3)操作过程：接种和培养基的转移应在酒精灯火焰旁进行，避免周围微生物的污染。(4)培养基转移时，不能将培养基沾到容器口或壁，否则会发生污染。因此转移培养基时应用三角漏斗或移液管操作。(P21—15)(5)操作完成后，仪器要灭菌后再保存，使用过的培养基要灭菌后再倒掉。(6) 试管或三角瓶口：棉塞不能用脱脂棉，以免吸水引起污染。棉塞也可用封口膜替代或6层纱布封口。( P20一倒7 )
（7）操作仪器要灭菌（P20--倒11）:培养皿、三角瓶、试管、移液管等常用高压蒸汽法灭菌，且灭菌后的仪器要避免与周围物品接触。接种环常用灼烧灭菌。玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在70 %的酒精中，使用时放在酒精灯火焰上，直到熄灭（P27--2）（8）一般培养基：常用高压蒸汽法灭菌，（9）特殊培养基：若培养基中含有葡萄糖，为防止其碳化，应在500g/cm2压力、90°C以上灭菌30分钟。（P21--9）若培养基中含有加热会分解的物质如尿素，则只能用G6玻璃砂漏斗过滤处理。
注意：G6玻璃砂漏斗孔径最小，细菌不能滤过，使用前也要在121℃下用纸包好灭菌，使用后需用1ml/L的HCI浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至中性，干燥后保存。
例4：下列对灭菌的理解不正确的是 （ ） Ａ．防止杂菌污染 Ｂ．接种前菌种要进行灭菌 Ｃ．培养基和发酵设备都必须灭菌 Ｄ．灭菌必须在接种前例5.关于灭菌和消毒的理解不正确的是 （ ） Ａ．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子 Ｂ．消毒和灭菌实质上是相同的 Ｃ．接种环用灼烧的方法灭菌 Ｄ．常用灭菌方法有加热法、过滤法、红外线法、化学药品法例6．培养微生物时必须进行无菌操作，下列消毒灭菌方法中，常用于各种器皿灭菌的是 （ ） Ａ．７０％酒精浸泡 Ｂ．紫外线照射 Ｃ．高压蒸汽法 Ｄ．５％次氯酸钠溶液浸泡
将菌种从一个培养基转移到另一培养基中培养
（1）工具：通常用接种环，也可能用移液管（2）步骤：灼烧→冷却→取菌种→转移。整个过程要在酒精灯火焰旁 旁进行。
将菌种转移到液体培养基中，并在摇床上振荡培养。 （液体悬浮培养）
通过振荡培养，可以让培养基和细菌充分混合，利于细菌数量的大量增加
通过划线分离法和涂布分离法等方法获得单菌落
意义： 单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一.（P19-9）
a.原理 ：接种环划线的过程中，菌液被逐渐稀释，最终出现单个细菌，培养后形成单菌落。 P20-4
不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。
（1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；（2） 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
防止冷凝水流到培养基中，避免造成污染，防止单菌落被冲散
接种环冷却后，蘸取带菌培养物
在酒精灯火焰旁，让带菌种的接种环在固体培养基上第一区划线。
烧灼接种环，从第一区末端开始往第二区划线
烧灼接种环，从第二区末端开始往第三区划线
烧灼接种环，从第三区末端开始往第四区划线
烧灼接种环，从第四区末端开始往第五区划线
烧灼接种环， 避免污染
培养皿倒置，放入培养箱培养
用接种环蘸菌液____次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的______开始。每次划线前接种环要 ，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的 。若共划线五次，接种环要烧灼____次。另外：每次划线都不能与之前的线条_____；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_____培养基。培养基需 后，放入培养箱培养。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环：是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；
每次划线前灼烧接种环：是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束后仍灼烧接种环：能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
例7：在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种 （甲）、培养结果（乙）如图所示。 有关叙述错误的是 （ ） Ａ．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 Ｂ．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 Ｃ．接种过程中至少需要对接种环灼烧 ５ 次 Ｄ．甲中 ａ 区域为划线的起始位置例8．下列有关微生物培养的叙述中，不正确的是 （ ） Ａ．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染 Ｂ．单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法 Ｃ．培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌 Ｄ．倒置平板防止培养皿盖上的冷凝水滴落
例9：下列有关划线分离操作的叙述错误的是 （ ） Ａ．必须使用固体培养基 Ｂ．必须在酒精灯火焰旁接种 Ｃ．必须将接种后的培养皿倒置培养 Ｄ．必须将接种前的培养皿、培养基、待分离微生物等进行灭菌处理例10：要筛选得到纯 净的菌种，通常在固体培养基上划线分离，下列操作正确的是（ ） Ａ．每次划线时，接种环都需蘸菌液一次 Ｂ．划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种 Ｃ．在超净台中接种时要在酒精灯火焰旁进行 Ｄ．划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
例11： 若实验室为分离纯化优良菌种进 行如下操作，排序最合理的是 （ ） Ａ．②①④③ Ｂ．②①④①③② Ｃ．②①④②③② Ｄ．①④①③②
（2）涂布分离法
a.原理 ：用无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落。 p20
将菌液进行一系列的梯度稀释，通常稀释到10－7 ～10－５倍，然后用移液管取0.1ml不同稀释度的菌液，用玻璃刮刀（涂布器）涂布到固体培养基的表面，进行培养。在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落，通常以一个培养皿内得到20个以内的单菌落最为适宜。
稀释菌液 （10-5 ~ 10-7倍）
用移液管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。
用移液管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。
涂布分离：单菌落更易分开，可用于计数，但操作复杂。
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开，不能计数。
例12：划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 （ ） Ａ．都要将菌液进行一系列的梯度稀释Ｂ．划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作 Ｃ．涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养 Ｄ．都能在培养基表面形成单个菌落
例题13：（ 温州十校联合体期初联考）有些细菌 可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。 某同学欲从 污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 请回答下列问题： （１）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于 培养基。 （２）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即 和 。 常用的操作工具分别是 和 。 （３）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小， 分解圈大说明该菌株的降解能力 。 （４）实验室常用的灭菌方法有过滤灭菌法、 和 。 无菌技术要求实验操作应 在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 ????????????????????????????????????�
某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。 该同学的接种方法是 ； 推测该同学接种时可能的操作失误是 。
现取5mL陈泡菜汁用于测定其中的乳酸菌含量,可采取 方法进行操作:取0.5mL泡菜汁逐级稀释至10-5,取10-4、10-5稀释液各0.ImL,分别接种到固体培养基,置于特定环境培养48h后，菌落计数。若培养結果如下图所示，则5mL陈泡菜汁中乳酸菌约 个.
一般稀释到10-5 ~ 10-7倍
一个培养皿内得到20个以内的单菌落最为适宜
稀释前的浓度 = 稀释倍数 x 稀释后的浓度
菌体数量 = 浓度 x 体积
例题14：图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
（１）图甲是利用 法进行微生物接种，图乙是利用 法进行微生物接种。 （２）这两种方法所用的接种工具分别是 和 ； 对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是 和酒精消毒。 （３）下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是 （填“图甲”或“图乙”）。
（4）下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是（ ） 。 Ａ．利用图乙所示接种法可以分离微生物但不能对微生物进行计数Ｂ．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落Ｃ．以尿素为唯一氮源的培养基可分离出能利用尿素的细菌Ｄ．图乙所示接种法中使用的接种工具须保存在 ７０％的酒精中
四、大肠杆菌的培养和分离实验步骤（P22--8）
将LB液体和固体培养基及培养皿用高压蒸汽灭菌
将灭菌后冷却到60℃的LB固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.
将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37℃摇床中震荡培养12h。
用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置与37℃的恒温培养箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况
用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在 37℃的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保
（一）培养基配制、灭菌 （P22--8）
取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg/cm2压力灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离斜面培养基——保存纯净的菌种
灭菌后，通常将实验用具放入60~80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。
1.将有（为液体状的固体培养基）培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上；
2.打开超净台的紫外灯和过滤风 （注意打开紫外灯后人必须离开）
3.待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
4.在酒精灯火焰旁，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，带凝固后即形成平面。凝固后将培养皿倒置。
注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净台，使用紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.倒平板和接种在酒精灯火焰旁操作.4.倒平板时需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基冲散单菌落，避免造成污染.
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
1、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
将未接种的培养基（空白培养基）放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。（无菌检验）
2、如何检查培养基是否受杂菌的污染？
（三）大肠杆菌的扩大培养（P22--倒2）
将斜面培养基上的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的LB液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.应在火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜或棉塞复原.
在酒精灯火焰旁灼烧接种环，取摇床上培养12小时后的菌液在在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置于37℃的恒温培养箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况.
（四）大肠杆菌的划线分离（P23--10）
（五）菌种的保存：（P23--倒2）
1.临时保藏：2.长期保存：
用接种环取单菌落，用划线法接种于固体斜面培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保存 。
总结：大肠杆菌的培养和分离实验的操作过程
1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。
1、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？
2、为何要将平板倒置？
恒温培养时，培养基中的水分会蒸发，如果正放培养皿，则水分蒸发遇到盖子凝结，形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌体会随水扩散，菌落间相互影响，很难得到单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。
3、实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。
4、如何判断接种操作是否符合无菌要求？
1（ 嘉兴期末）下列问题有关大肠杆菌的 培养实验，请回答： （１）配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜 素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和 作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的 。 （２）大肠杆菌培养和分离的实验中，在 中进行扩大培养，培养液经 后，在LB固体培养基上 进行 ，并将培养皿 放在恒温培养箱中培养，可以获得如图效果。 为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及 ，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。 （３）通常对获得的纯菌种可以依据 的形状、大小等 特征进行初步的鉴定。 （４）关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中，下列叙述正确的是（ ） Ａ．高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针 回到零后，开启锅盖 Ｂ．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 Ｃ．为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 Ｄ．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
2、下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤：（１）实验用的器具必须是无菌的，常用____________法灭菌。 用此法对培养基灭菌时，常将培养基装在_______器皿中进行。（２）实验操作需在________上进行。 实验前一段时间需打开，实验中需关闭的是_____。Ａ．酒精灯 Ｂ．照明灯 Ｃ．过滤风 Ｄ．紫外灯（３）平面培养基与悬浮培养所用的培养基相比，应增加______成分。____________是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达两菌株的最简便的方法之一
2、下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤：（４）常用涂布法接种。 下列叙述错误的是_____（多选）。A接种的目的是使细菌相互分离B．接种需过滤除去杂菌后进行C．接种工具需灼烧后使用 D．接种需在酒精灯火焰上进行（５）在 ３７ ℃恒温箱中培养时，培养皿需________，主要目的是避免水滴影响________的形成。（６）培养后，如果观察到菌落重叠，则在涂布法接种之前需进行__________操作。
3．［浙江名校协作体高三联考］生活饮用水中的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答下列问题：（１）培养大肠杆菌所用的ＬＢ 培养基一般用_____________法灭菌。检测大肠杆菌的含量时，通常将水样用______进行一系列的梯度稀释。（２）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀______到ＬＢ 固体培养基上，______于恒温培养箱，在_____℃ 条件下进行培养。用该方法统计样本菌落数时______（填需要或不需要）设置对照组。
3．［浙江名校协作体高三联考］生活饮用水中的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答下列问题：（３）如图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_____。Ａ．步骤①倒平板操作时，倒好培养基后应立即将其倒过来放置Ｂ．步骤②接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液划线Ｃ．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落Ｄ．步骤④用恒温培养箱培养后可对大肠杆菌进行计数
4．（ 浙江杭州一模） 据报道，一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标，加上熟卤制品的大肠杆菌超标，“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：（１）某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCI、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后________，分装到锥形瓶后利用_____________进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液（100ｍＬ１０％灭菌NaCI溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀）摇匀后立即倒平板。接种：该小组采用___________法检测果汁样品的细菌含量。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________；然后，将 1mL果汁样品稀释10倍，在３个平板上用涂布法分别接入0.1mL 稀释液。培养及结果：将培养皿_______放入恒温培养箱中经适当培养，３个平板上的菌落数分别为19、18和17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为____________。
检测培养基平板灭菌是否合格
一.实验目的二.实验仪器三.微生物培养涉及的重要概念介绍四.实验步骤五.思考题
实验一 大肠杆菌的培养和分离
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平面培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理
三.微生物培养涉及的重要概念介绍
（一）大肠杆菌（E. cli）
（四）无菌操作技术
（五）主要实验过程
指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或无细胞结构的低等生物。
革兰氏______（填阴或阳）性菌
1.特点： P19-1
（大肠杆菌是肠道内的共生菌群，一般无害）
2.与人类关系：（P19---2）
有益：合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。有害：少数有害，可以侵染肠粘膜并产生毒素，任何大肠杆菌进 入人的泌尿系统都会有害
3.生活环境： 最适温度370C、最适pH值=7.0
4.用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具 P19-4
例如：①重组的人粒细胞——巨噬细胞集落刺激因子，是一种蛋白质，能 提高人的白细胞的含量，放疗、化疗必用辅助药物。 ②胰岛素——治疗糖尿病的药物
单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。(每一个细菌可产生一个菌落)
不同细菌的菌落的大小、形态、隆起、边缘、表面状况、质地、颜色、硬度、透明度等方面不同。
3.应用 菌落是鉴定菌种的重要依据。
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
①液体培养基： 不加入凝固剂，常用于扩大培养、工业生产
③固体培养基： 加入适量凝固剂，常用于菌种的分离、计数、 鉴定
②半固体培养基：加入少量凝固剂，常用于菌种保存、观察微 生物的运动
思考：动物细胞培养，植物组织培养分别用什么培养基？获得植物的原生质体用何种培养基？
①选择培养基：在普通培养基中添加或减少某种化学成分，允许特定微生物的生长，抑制不需要的微生生长。用于菌种的分离
例1：下列过程用到选择培养基的是________ A、获得抗盐、抗病的突变体植株 B、获得能利用尿素的细菌 C、获得杂交瘤细胞 D、获得含胰岛素基因的大肠杆菌
②鉴定培养基：在普通培养基中添加某种指示剂或化学药品，用于菌种的鉴定。
如：加酚红的以尿素为唯一氮源的培养基能鉴定是否有分解尿素的细菌以及分解尿素的能力
不同的微生物往往需要用不同的培养基配方，不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透压的要求．
（1）不同微生物需要的培养基中的营养物质不同
细菌喜荤（蛋白质） 霉菌喜素（糖类）
思考：LB培养基中提供碳源的是_____。提供氮源的是_____。NaCl的作用是_____。LB培养基能用来培养食用菌吗？______。
（2）不同微生物需要的PH不同
细菌 6.5-7.5 中性偏碱真菌 5.0-6.0 中性偏酸
（3）微生物需要的合适的温度
通常加入一定量的NaCl，来维持一定的渗透压
例题1：某一种细菌要从环境中提取现成的亮氨 酸（20种氨基酸中的一种） 才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。 根 据实验的目的，选用的培养基类型是（ ）
例2：不同培养基的具体配方不同，但一般都有 （ ） Ａ．氮源、磷酸盐和维生素 Ｂ．氮源和维生素 Ｃ．水、碳源、氮源和无机盐 Ｄ．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素例3．下列叙述正确的是 （ ） Ａ．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质 Ｂ．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基 Ｃ．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基 Ｄ．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染，获得纯净微生物的方法。
成功地培养微生物的关键
（1）灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。
（2）消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。
①100℃煮沸5-6min②高猛酸钾、次氯酸钠（植物外植体）③用75%酒精擦拭④紫外线消毒（空气中）
①灼烧灭菌②干热灭菌③高压蒸汽灭菌④过滤灭菌
作用对象：①实验操作场所（酒精）②操作空间（紫外线）③操作者的衣和手（酒精）④活的实验材料等
作用对象：①培养基②微生物的培养器皿③操作工具等直接接触微生物的物体
①灼烧灭菌②高压蒸汽灭菌（P20-倒4）灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好1kg/cm2、121℃ 下维持15min.③过滤灭菌滤除直径1.5-0.6 μm的病菌④干热灭菌
①化学药剂消毒法: 用75%酒精、高猛酸钾、5%的次氯酸钠等消毒②紫外线消毒（空气）
操作空间（超净台） 75%酒精擦、紫外灯、过滤风
(1)操作空间要消毒：紫外线、过滤风。(P21—1)(2)操作场所(超净台)和实验者的手要消毒：用70%的酒精擦(3)操作过程：接种和培养基的转移应在酒精灯火焰旁进行，避免周围微生物的污染。(4)培养基转移时，不能将培养基沾到容器口或壁，否则会发生污染。因此转移培养基时应用三角漏斗或移液管操作。(P21—15)(5)操作完成后，仪器要灭菌后再保存，使用过的培养基要灭菌后再倒掉。(6) 试管或三角瓶口：棉塞不能用脱脂棉，以免吸水引起污染。棉塞也可用封口膜替代或6层纱布封口。( P20一倒7 )
（7）操作仪器要灭菌（P20--倒11）:培养皿、三角瓶、试管、移液管等常用高压蒸汽法灭菌，且灭菌后的仪器要避免与周围物品接触。接种环常用灼烧灭菌。玻璃刮刀（涂布器）使用前保存在70 %的酒精中，使用时放在酒精灯火焰上，直到熄灭（P27--2）（8）一般培养基：常用高压蒸汽法灭菌，（9）特殊培养基：若培养基中含有葡萄糖，为防止其碳化，应在500g/cm2压力、90°C以上灭菌30分钟。（P21--9）若培养基中含有加热会分解的物质如尿素，则只能用G6玻璃砂漏斗过滤处理。
注意：G6玻璃砂漏斗孔径最小，细菌不能滤过，使用前也要在121℃下用纸包好灭菌，使用后需用1ml/L的HCI浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至中性，干燥后保存。
例4：下列对灭菌的理解不正确的是 （ ） Ａ．防止杂菌污染 Ｂ．接种前菌种要进行灭菌 Ｃ．培养基和发酵设备都必须灭菌 Ｄ．灭菌必须在接种前例5.关于灭菌和消毒的理解不正确的是 （ ） Ａ．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子 Ｂ．消毒和灭菌实质上是相同的 Ｃ．接种环用灼烧的方法灭菌 Ｄ．常用灭菌方法有加热法、过滤法、红外线法、化学药品法例6．培养微生物时必须进行无菌操作，下列消毒灭菌方法中，常用于各种器皿灭菌的是 （ ） Ａ．７０％酒精浸泡 Ｂ．紫外线照射 Ｃ．高压蒸汽法 Ｄ．５％次氯酸钠溶液浸泡
将菌种从一个培养基转移到另一培养基中培养
（1）工具：通常用接种环，也可能用移液管（2）步骤：灼烧→冷却→取菌种→转移。整个过程要在酒精灯火焰旁 旁进行。
将菌种转移到液体培养基中，并在摇床上振荡培养。 （液体悬浮培养）
通过振荡培养，可以让培养基和细菌充分混合，利于细菌数量的大量增加
通过划线分离法和涂布分离法等方法获得单菌落
意义： 单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一.（P19-9）
a.原理 ：接种环划线的过程中，菌液被逐渐稀释，最终出现单个细菌，培养后形成单菌落。 P20-4
不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。
（1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；（2） 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
防止冷凝水流到培养基中，避免造成污染，防止单菌落被冲散
接种环冷却后，蘸取带菌培养物
在酒精灯火焰旁，让带菌种的接种环在固体培养基上第一区划线。
烧灼接种环，从第一区末端开始往第二区划线
烧灼接种环，从第二区末端开始往第三区划线
烧灼接种环，从第三区末端开始往第四区划线
烧灼接种环，从第四区末端开始往第五区划线
烧灼接种环， 避免污染
培养皿倒置，放入培养箱培养
用接种环蘸菌液____次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的______开始。每次划线前接种环要 ，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的 。若共划线五次，接种环要烧灼____次。另外：每次划线都不能与之前的线条_____；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_____培养基。培养基需 后，放入培养箱培养。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环：是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；
每次划线前灼烧接种环：是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束后仍灼烧接种环：能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
例7：在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种 （甲）、培养结果（乙）如图所示。 有关叙述错误的是 （ ） Ａ．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 Ｂ．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 Ｃ．接种过程中至少需要对接种环灼烧 ５ 次 Ｄ．甲中 ａ 区域为划线的起始位置例8．下列有关微生物培养的叙述中，不正确的是 （ ） Ａ．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染 Ｂ．单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法 Ｃ．培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌 Ｄ．倒置平板防止培养皿盖上的冷凝水滴落
例9：下列有关划线分离操作的叙述错误的是 （ ） Ａ．必须使用固体培养基 Ｂ．必须在酒精灯火焰旁接种 Ｃ．必须将接种后的培养皿倒置培养 Ｄ．必须将接种前的培养皿、培养基、待分离微生物等进行灭菌处理例10：要筛选得到纯 净的菌种，通常在固体培养基上划线分离，下列操作正确的是（ ） Ａ．每次划线时，接种环都需蘸菌液一次 Ｂ．划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种 Ｃ．在超净台中接种时要在酒精灯火焰旁进行 Ｄ．划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养
例11： 若实验室为分离纯化优良菌种进 行如下操作，排序最合理的是 （ ） Ａ．②①④③ Ｂ．②①④①③② Ｃ．②①④②③② Ｄ．①④①③②
（2）涂布分离法
a.原理 ：用无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落。 p20
将菌液进行一系列的梯度稀释，通常稀释到10－7 ～10－５倍，然后用移液管取0.1ml不同稀释度的菌液，用玻璃刮刀（涂布器）涂布到固体培养基的表面，进行培养。在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落，通常以一个培养皿内得到20个以内的单菌落最为适宜。
稀释菌液 （10-5 ~ 10-7倍）
用移液管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。
用移液管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。
涂布分离：单菌落更易分开，可用于计数，但操作复杂。
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开，不能计数。
例12：划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 （ ） Ａ．都要将菌液进行一系列的梯度稀释Ｂ．划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作 Ｃ．涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养 Ｄ．都能在培养基表面形成单个菌落
例题13：（ 温州十校联合体期初联考）有些细菌 可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。 某同学欲从 污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 请回答下列问题： （１）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于 培养基。 （２）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即 和 。 常用的操作工具分别是 和 。 （３）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小， 分解圈大说明该菌株的降解能力 。 （４）实验室常用的灭菌方法有过滤灭菌法、 和 。 无菌技术要求实验操作应 在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 ????????????????????????????????????�
某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。 该同学的接种方法是 ； 推测该同学接种时可能的操作失误是 。
现取5mL陈泡菜汁用于测定其中的乳酸菌含量,可采取 方法进行操作:取0.5mL泡菜汁逐级稀释至10-5,取10-4、10-5稀释液各0.ImL,分别接种到固体培养基,置于特定环境培养48h后，菌落计数。若培养結果如下图所示，则5mL陈泡菜汁中乳酸菌约 个.
一般稀释到10-5 ~ 10-7倍
一个培养皿内得到20个以内的单菌落最为适宜
稀释前的浓度 = 稀释倍数 x 稀释后的浓度
菌体数量 = 浓度 x 体积
例题14：图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：
（１）图甲是利用 法进行微生物接种，图乙是利用 法进行微生物接种。 （２）这两种方法所用的接种工具分别是 和 ； 对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是 和酒精消毒。 （３）下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是 （填“图甲”或“图乙”）。
（4）下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是（ ） 。 Ａ．利用图乙所示接种法可以分离微生物但不能对微生物进行计数Ｂ．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落Ｃ．以尿素为唯一氮源的培养基可分离出能利用尿素的细菌Ｄ．图乙所示接种法中使用的接种工具须保存在 ７０％的酒精中
四、大肠杆菌的培养和分离实验步骤（P22--8）
将LB液体和固体培养基及培养皿用高压蒸汽灭菌
将灭菌后冷却到60℃的LB固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.
将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37℃摇床中震荡培养12h。
用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置与37℃的恒温培养箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况
用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在 37℃的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保
（一）培养基配制、灭菌 （P22--8）
取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg/cm2压力灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离斜面培养基——保存纯净的菌种
灭菌后，通常将实验用具放入60~80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。
1.将有（为液体状的固体培养基）培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上；
2.打开超净台的紫外灯和过滤风 （注意打开紫外灯后人必须离开）
3.待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），关闭紫外灯，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
4.在酒精灯火焰旁，将三角瓶中的培养基倒在培养皿里。将培养基分别倒至4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，带凝固后即形成平面。凝固后将培养皿倒置。
注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净台，使用紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.倒平板和接种在酒精灯火焰旁操作.4.倒平板时需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基冲散单菌落，避免造成污染.
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
1、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
将未接种的培养基（空白培养基）放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。（无菌检验）
2、如何检查培养基是否受杂菌的污染？
（三）大肠杆菌的扩大培养（P22--倒2）
将斜面培养基上的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的LB液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.应在火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜或棉塞复原.
在酒精灯火焰旁灼烧接种环，取摇床上培养12小时后的菌液在在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置于37℃的恒温培养箱中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况.
（四）大肠杆菌的划线分离（P23--10）
（五）菌种的保存：（P23--倒2）
1.临时保藏：2.长期保存：
用接种环取单菌落，用划线法接种于固体斜面培养基上，在37℃的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保存 。
总结：大肠杆菌的培养和分离实验的操作过程
1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。
1、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？
2、为何要将平板倒置？
恒温培养时，培养基中的水分会蒸发，如果正放培养皿，则水分蒸发遇到盖子凝结，形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌体会随水扩散，菌落间相互影响，很难得到单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。
3、实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。
4、如何判断接种操作是否符合无菌要求？
1（ 嘉兴期末）下列问题有关大肠杆菌的 培养实验，请回答： （１）配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜 素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和 作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的 。 （２）大肠杆菌培养和分离的实验中，在 中进行扩大培养，培养液经 后，在LB固体培养基上 进行 ，并将培养皿 放在恒温培养箱中培养，可以获得如图效果。 为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及 ，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。 （３）通常对获得的纯菌种可以依据 的形状、大小等 特征进行初步的鉴定。 （４）关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中，下列叙述正确的是（ ） Ａ．高压蒸汽灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针 回到零后，开启锅盖 Ｂ．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 Ｃ．为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 Ｄ．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
2、下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤：（１）实验用的器具必须是无菌的，常用____________法灭菌。 用此法对培养基灭菌时，常将培养基装在_______器皿中进行。（２）实验操作需在________上进行。 实验前一段时间需打开，实验中需关闭的是_____。Ａ．酒精灯 Ｂ．照明灯 Ｃ．过滤风 Ｄ．紫外灯（３）平面培养基与悬浮培养所用的培养基相比，应增加______成分。____________是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达两菌株的最简便的方法之一
2、下面是肺炎双球菌离体转化实验的主要步骤：（４）常用涂布法接种。 下列叙述错误的是_____（多选）。A接种的目的是使细菌相互分离B．接种需过滤除去杂菌后进行C．接种工具需灼烧后使用 D．接种需在酒精灯火焰上进行（５）在 ３７ ℃恒温箱中培养时，培养皿需________，主要目的是避免水滴影响________的形成。（６）培养后，如果观察到菌落重叠，则在涂布法接种之前需进行__________操作。
3．［浙江名校协作体高三联考］生活饮用水中的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答下列问题：（１）培养大肠杆菌所用的ＬＢ 培养基一般用_____________法灭菌。检测大肠杆菌的含量时，通常将水样用______进行一系列的梯度稀释。（２）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀______到ＬＢ 固体培养基上，______于恒温培养箱，在_____℃ 条件下进行培养。用该方法统计样本菌落数时______（填需要或不需要）设置对照组。
3．［浙江名校协作体高三联考］生活饮用水中的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答下列问题：（３）如图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_____。Ａ．步骤①倒平板操作时，倒好培养基后应立即将其倒过来放置Ｂ．步骤②接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液划线Ｃ．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落Ｄ．步骤④用恒温培养箱培养后可对大肠杆菌进行计数
4．（ 浙江杭州一模） 据报道，一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标，加上熟卤制品的大肠杆菌超标，“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：（１）某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCI、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后________，分装到锥形瓶后利用_____________进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液（100ｍＬ１０％灭菌NaCI溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀）摇匀后立即倒平板。接种：该小组采用___________法检测果汁样品的细菌含量。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________________________；然后，将 1mL果汁样品稀释10倍，在３个平板上用涂布法分别接入0.1mL 稀释液。培养及结果：将培养皿_______放入恒温培养箱中经适当培养，３个平板上的菌落数分别为19、18和17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为____________。
检测培养基平板灭菌是否合格
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