人教版 (新课标)选修3《现代生物科技专题》专题1 基因工程1.2 基因工程的基本操作程序教案

1.2 基因工程的基本操作程序

一、 教学目标

1.简述基因工程原理及基本操作程序。

2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。

二、 教学重点和难点

1.教学重点

基因工程基本操作程序的四个步骤。

2.教学难点

（1）从基因文库中获取目的基因。

（2）利用PCR技术扩增目的基因。

三、 教学策略

本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。本节教学难点多，学生学习有一定的困难，因此建议采取化整为零、各个击破的教学策略。

1.加强预习环节，先解决为什么要分四个步骤的问题，然后解决每一步骤的技术方法问题。

为了突破难点及培养自学能力，在上节课结束时，可布置学生预习本节内容。在上新课时，首先解决基因工程的基本操作程序为什么要分四个步骤，即分析每一步骤的必要性。

为什么要有“目的基因的获取”这一步？建议引导学生看本专题题图中基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组妥虻燃际酰秤枭镆孕碌囊糯匦裕丛斐龈先嗣切枰男碌纳锢嘈秃蜕锊贰！笨梢运嫡饧仁歉拍睿彩窃怼Ｕ饫锼档摹案先嗣切枰保褪悄康模敲锤先嗣切枰哪歉龌蚓褪悄康幕蛄恕Ｓ辛四康幕颍颐遣拍芨秤枰恢稚镆粤硪恢稚锏囊糯匦浴?/FONT>

为什么要有“表达载体的构建”这一步？单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。课文中谈到构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。

为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。

在解决上述为什么基因工程操作程序分四个步骤的基础上，进入每一程序的有关技术和方法的学习。

2.加强教学媒体的运用，解决每一程序中的技术难点。

在各个操作程序中都有一些技术和方法层面上的难点不好理解，成为学生学习过程的拦路虎。形象化是解决这一难题的好办法。例如，在目的基因获取的常用方法中有“从基因文库中获得目的基因”的说法。尽管课文中运用了比喻的方法，但语言文字仍显抽象。教师应尽可能在教学中编制软件、绘制投影片或利用挂图来解决这一难点。让学生了解有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。而有关PCR扩增技术，则可结合书中插图，明示出文字中概括出的变性、退火、延伸、多次重复等四个过程。

又如，在学习基因表达载体的构建方法时，可结合插图，说明插入必要的元件──目的基因、启动子、终止子和标记基因的位置及其作用。

再如，学习目的基因导入方法时，可借用目的基因导入植物细胞的方法──农杆菌转化法以及相关的图，讲清具体方法。攻破一点后，再扩展到其他导入方法。

3.通过设计某一转基因生物，将基因工程的操作程序有机地串联起来。

本节学习的基因工程的基本操作程序和方法是对转基因植物、动物、微生物的概括。如果在本课将要结束时，做个练习，带领学生结合设计某一转基因生物的具体过程，可将基因工程操作程序有机地串起来，从而加深对这一程序的认识。例如，烟草是人类健康的“杀手”。如果让它生产出人类需要的药物蛋白，应如何操作？通过这一实例引导学生结合目的基因从何而来，表达载体如何构建，如何导入烟草，如何检测药物蛋白产生与否等问题加以设计。可加深学生对基因工程原理的理解。不同学生会有不同的方法，让学生通过相互比较，相互借鉴，达到相互学习的目的。学生在课下还可查阅《科学》杂志等参考读物，了解科学家成功的做法。

四、 答案和提示

（一）思考与探究

1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：

（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；

（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；

（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；

（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；

（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。

2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？

提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。

根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。

需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。

如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。

4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

提示：基本操作如下：

（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。

（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。

（二）求异思维

你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？

提示：1970年，特明（H.M. Temin）和巴尔的摩（D. Baltimore）证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶，这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶，由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的，所以称为反转录酶（reverse transcriptase）。

反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA（图1-3）。

图1-3 由mRNA反转录形成cDNA的过程

cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

（三）寻根问底

1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？

提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

2.将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？

提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。

五、 知识拓展

1.PCR的扩增过程是怎样的？

PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。

第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。

第二步：将反应体系降温至55～60 ℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。

第三步：将反应体系升温至70～75 ℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。

上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

2.如何从基因文库中找到所需要的基因？

从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。

第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。

第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。

第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。

第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。

第五步，从该菌落中再提取目的基因。

3.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？

主要考虑以下几方面的因素。

（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。

（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。

（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。

4.什么是分子杂交技术的显示带？

分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术，主要用于检测和鉴定，可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。常用的技术有：

Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。

Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与Southern杂交相同。

Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。