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2020版新一线高考生物（苏教版）一轮复习教学案：选修3第2讲 细胞工程
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第2讲 细胞工程
[考纲展示] 1.植物的组织培养(Ⅱ) 2.动物细胞培养与体细胞克隆 (Ⅱ) 3.细胞融合与单克隆抗体 (Ⅱ)
考点一| 植物组织培养与植物体细胞杂交
1．细胞工程
(1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。
(2)目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
(3)类型：根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程。
2．植物组织培养技术
(1)概念理解
①培养对象：离体的植物组织、器官、细胞或原生质体。
②培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关激素等人工控制条件。
③培养结果：产生部分或完整植株。
(2)理论基础：植物细胞的全能性。
①含义：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。
②物质基础：细胞内含有本物种全部的遗传信息。
(3)填写操作过程图
―→
图中①表示脱分化，②表示再分化，A表示愈伤组织，B表示丛芽或胚状体。
3．植物体细胞杂交技术
(1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
(2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。
(3)过程
(4)意义：克服不同种生物远缘杂交不亲和的障碍、获得杂种植株。
4．植物细胞工程的实际应用
(1)植物繁殖的新途径
①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。
②作物脱毒：选取作物茎尖、根尖等无毒组织进行组织培养，获得脱毒苗的技术。
③人工种子：胚状体等外包裹人工薄膜得到的种子，可以解决某些植物结实率低、繁殖困难的问题。
(2)作物新品种的培育：单倍体育种和突变体的利用。
(3)细胞产物的工厂化生产：即利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等。
[思考回答]
1．通过植物体细胞杂交形成的杂交植株是否一定可育？
提示：是否可育看同源染色体能否正常联会。若植物体细胞杂交过程得到的杂种植物存在同源染色体，能正常联会，则可育。
2．如图表示植物分化、脱分化和再分化过程及其关系。试回答相关问题：
(1)脱分化形成的愈伤组织细胞与正常体细胞相比，前者在结构的特点是什么？
提示：高度液泡化、无定形、细胞壁薄。
(2)经脱分化形成愈伤组织为什么需要避光培养？
提示：避光的作用是为了愈伤组织的形成，若给予光照，则会不同程度的形成维管组织(处于已分化状态)，就不能继续分化，造成组织培养失败。
(3)利用紫草细胞脱分化形成的愈伤组织细胞进行培养提取紫草素，与常规的从植物体内提取具有的明显优点有哪些？(至少答出三点)
提示：可以克服地理、气候等植物生长环境条件的限制，实现工业化、自动化生产；产量大、纯度高。
(4)从分化、脱分化和再分化的结果看，它们的实质都是什么？
提示：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。
1．细胞全能性
(1)原理：细胞内含有本物种全部的遗传信息。
(2)体内细胞全能性不表达的原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达。
(3)细胞全能性表达的条件：具完整细胞结构，离体，无菌，一定的营养、激素和其他适宜的外界条件。
(4)细胞全能性大小与细胞分化程度成反比。
2．激素比例与细胞分裂分化的关系
(1)适当提高生长素与细胞分裂素的比例容易生根。
(2)适当提高细胞分裂素与生长素的比例容易生芽。
(3)比例适中诱导产生愈伤组织。如图所示：
3．对不同物种植物体细胞杂交和有性杂交的比较
(1)结果不同
①体细胞杂交：不管染色体数、基因组还是染色体组都采用直接相加。
②植物有性杂交：先减半再相加。
(2)适用的定律不同
①有性生殖过程中符合孟德尔遗传定律。
②植物体细胞杂交：属于无性生殖，不符合孟德尔遗传定律。
◎考法1 考查植物组织培养过程分析
1．(2017·海南高考)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：
(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是______________________。
(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到______________。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是____________________(填“具有完整的细胞核” “具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。
(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是________________。A中的愈伤组织是叶肉细胞经________形成的。
(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，________(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)外植体在一定条件下进行组织培养获得试管苗的原理是植物细胞的全能性。
(2)蔗糖水解后可得到一分子的葡萄糖和一分子果糖；若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是应该具备整套遗传物质，即具有完整的细胞核。
(3)在植物组织培养过程中加入的细胞分裂素、生长素的比例不同，诱导形成的器官不同；外植体经脱分化形成愈伤组织，再分化形成完整的植株。
(4)依题意不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株。
答案：(1)植物细胞的全能性 (2)葡萄糖、果糖 具有完整的细胞核 (3)细胞分裂素、生长素 脱分化 (4)不能 对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到花卉基因型不同于原植株
◎考法2 考查植物细胞工程技术及应用
2．甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。
回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的 ________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成 ________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为____________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的 ______________________________________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
解析：(1)植物体细胞杂交的过程包括植物细胞融合和植物组织培养，其过程依次为酶解法去除植物细胞的细胞壁、用物理或化学法诱导原生质体融合、杂种细胞再生出细胞壁、杂种细胞经植物组织培养(脱分化形成愈伤组织，再分化形成幼根和芽进而形成完整植株)培育成完整植株。其中，酶解法去除植物细胞的细胞壁利用了酶的专一性，选择纤维素酶和果胶酶，水解植物细胞的细胞壁的主要成分——纤维素和果胶，暴露出有活力的原生质体。(2)多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上的染色体组的个体。甲和乙均为二倍体植物，假设二者有性杂交的后代不可育，其原因是该后代在进行减数第一次分裂过程中，由于没有同源染色体，联会出现紊乱，不能产生可育的配子。而植物体细胞杂交产生的杂种植株，细胞内含有原物种体细胞内的染色体，在减数第一次分裂过程中能够进行同源染色体配对，产生可育的配子。(3)经植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等，用人工薄膜包装后可得到人工种子。
答案：(1)纤维素 果胶 原生质体 愈伤 再分化(或分化) 植物体细胞杂交技术 (2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体(其他合理答案也可以) 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常(其他合理答案也可以) (3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一个即可)
3．回答下列有关植物细胞工程应用有关的问题：
(1)植物细胞工程可用于培养脱毒苗，这一方法的原理是__________________，所以再生的植株可能不带病毒。
(2)微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗________，而与________配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要适宜的生长调节剂是________(填“脱落酸”或“2，4D”)。
(3)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)利用茎尖等分生部位进行组织培养获得脱毒苗的原理是植物体细胞具有全能性。
(2)适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗生根。微型繁殖培养基中使用的生长素与细胞分裂素比例不同，可以分别诱导根、芽的形成。使用高浓度的植物生长素类似物(如2，4D)可以抑制试管苗的生长。
(3)由蔗糖浓度下降可知，外植体离体培养过程中需要消耗蔗糖，12天后蔗糖浓度变化不大；pH下降会影响酶的活性，愈伤组织细胞不能进行光合作用，对物质的合成小于分解，故细胞干重下降。
答案：(1)植物细胞的全能性 (2)生根 细胞分裂素 2，4D (3)蔗糖浓度下降，pH降低考点二| 动物细胞与组织培养和核移植技术
1．动物细胞与组织培养
(1)过程
(2)动物细胞培养与动物组织培养的主要区别：动物细胞培养过程需用胰蛋白酶等处理组织块，以使细胞离散，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。
(3)培养条件
①环境条件：无菌、温度适宜和营养充足、pH适宜等。
②培养基种类
a．天然培养基：主要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，其特点是营养价值高、成分复杂。
b．合成培养基：人工配制的，其成分明确，便于控制实验条件，使用时需加入动物血清。
(4)培养类型
①原代培养：从供体获取组织或细胞后的初次培养。
②传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养，培养代数一般在10～50代左右。
2．动物体细胞核移植技术
(1)动物体细胞核移植技术的过程
重组细胞胚胎代孕母体―→生出与细胞核供体遗传性状基本相同的个体
(2)原理：动物体细胞核具有全能性。
(3)应用
①生产医用蛋白。
②作为异种移植的供体。
③了解胚胎发育及人体衰老的过程
④追踪和研究疾病的发展过程以便更有效地治疗疾病。
3．体细胞克隆
(1)克隆不仅仅是指无性繁殖，还包括遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。
(2)体细胞克隆是指用体细胞核移植技术进行的克隆。
(3)克隆技术意义：在克服动物种间杂交繁殖障碍、创造新物种方面具有重要的科学意义和潜在的经济价值。
(4)应用
①加速家畜遗传改良进程，促进优良育群的繁育。
②保护濒危物种。
[思考回答]
1．动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用有何不同？
提示：第一次使用胰蛋白酶处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次用胰蛋白酶的目的是使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来，分散成单个细胞。
2．动物细胞工程技术推动了免疫学和畜牧业的发展。如图为通过体细胞核移植过程得到克隆牛的流程图。
→→→犊牛
(1)与去核卵母细胞融合的供体高产奶牛细胞培养一般不会超过10代，原因是什么？
提示：保持细胞正常的二倍体核型。
(2)动物体细胞核移植的难度高于胚胎细胞核移植的原因是什么？
提示：动物胚胎的细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
(3)在现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟体细胞，直接培养成一个新个体，而是将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，你认为最可能的原因是什么？
提示：卵细胞的细胞质可使体细胞核的全能性得到表达。
1．动物细胞培养和核移植时注意的五个问题
(1)在分散细胞时，需用胰蛋白酶分散细胞，不能用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.8，胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2～7.8，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4。
(2)取供体动物的体细胞培养，一般选用10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。
(3)克隆动物是由重组的细胞经培养而来的，该重组细胞的细胞质基因来源于受体细胞，细胞核基因来源于提供细胞核的亲本，其遗传物质来自两个亲本。
(4)克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
(5)从生殖方式的角度看，动物体细胞核移植技术(克隆)属无性生殖，重组细胞相当于受精卵，需要动物细胞培养和胚胎工程技术的支持。
2．动物细胞核移植的理解
(1)卵母细胞选择时期及原因：MⅡ中期的卵母细胞，此时具备受精能力，细胞质中合成与分裂、分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化，形成重组胚胎。
(2)选卵细胞作为受体细胞的原因
①卵细胞大，易于操作。
②卵黄多，营养丰富，为发育提供充足的营养。
③能激发重组细胞分裂分化。
(3)动物体细胞不能经培养直接发育成完整个体的原因：动物体细胞的全能性受到限制。
(4)该过程用到的技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养和胚胎移植。
◎考法1 考查动物细胞培养过程分析
1．某研究小组进行药物实验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为正常肝细胞，乙细胞为肝肿瘤细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_________________________________________________________________。
(2)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同，一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。
(3)在两种细胞生长过程中，当甲细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物实验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更________。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用________消化处理。
(4)某研究小组研究了血清对正常细胞和癌细胞培养的影响，实验结果如图。
从该图提供的信息可以获得的正确结论有
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)动物细胞培养时加入含5%CO2的目的是为了维持培养液的pH。(2)已知甲细胞为正常肝细胞，乙细胞为肝肿瘤细胞。肝肿瘤细胞比正常肝细胞的分裂能力强，细胞周期短，因此在其他条件相同时，相同时间内肝肿瘤细胞产生的子代细胞多。(3)甲细胞为正常肝细胞，存在接触抑制，而乙细胞为肿瘤细胞，已经失去接触抑制现象，因此在这两种细胞生长过程中，当甲细胞铺满瓶壁时，其生长停止。乙细胞能无限增殖，因此其传代的次数比甲多；胰蛋白酶能消化组织细胞间的蛋白质，使组织细胞分散成单个细胞。(4)从图中曲线可看出培养基中有无血清对癌细胞的培养影响不大，即二者的细胞数在曲线上差别不大。正常细胞的培养过程中有血清的培养基在相同时间内培养得到的细胞数远远多于无血清的培养基所获得的细胞数。癌细胞培养与正常细胞培养二者的差距比较大，正常细胞达到一定的数目后不再增加，而癌细胞却能不断增加。
答案：(1)维持培养液的pH (2)少 (3)停止 少 胰蛋白酶 (4)①有无血清对正常细胞培养的影响不同；②培养基中补充血清有助于正常细胞的培养；③培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大
◎考法2 考查细胞核移植技术及应用
2．(2016·全国卷Ⅱ)如图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用________的方法。②代表的过程是________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)哺乳动物的正常细胞核中性染色体的组成为XX(雌性)或XY(雄性)。卵母细胞在培养至减数第二次分裂的中期时，常采用显微操作法去除细胞核。②过程是将早期胚胎移植到代孕个体的子宫中，即代表的是胚胎移植。(2)一般来说，动物细胞在传代培养到10～50代时，部分细胞的细胞核型可能会发生变化，即遗传物质的稳定性会降低。因此，选材时一般选10代以内的细胞，以保证细胞正常的二倍体核型。(3)获得的克隆动物性状与供体动物基本相同，但不完全相同，从遗传物质的角度分析，性状不完全相同的原因是：克隆动物细胞质中的遗传物质来自去核卵母细胞的细胞质，细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。(4)高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，但其细胞核的全能性在卵母细胞细胞质中的物质的作用下仍能得以表达。故克隆羊“多莉(利)”以及其他克隆动物的培育成功，证明了高度分化的动物体细胞的细胞核仍具有全能性。
答案：(1)XX或XY 显微操作 胚胎移植 (2)遗传物质 (3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
[误区警示] 动物细胞核移植技术中的3个易错点
1．动物细胞核移植技术，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
2．克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
3．核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同的原因：(1)克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但其线粒体中的DNA来自去核卵(母)细胞。(2)性状受基因与环境共同影响。(3)在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。
考点三| 动物细胞融合与单克隆抗体
1．动物细胞融合
(1)概念：在一定条件下将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程。
(2)原理：细胞膜的流动性。
(3)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电刺激等。
(4)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体制备
(1)单克隆抗体制备过程
(2)单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备。
[思考回答]
1．若仅考虑细胞的两两融合，B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后产生的细胞有3种类型，原因是什么？
提示：出现不同种类型是因为细胞融合是随机的。
2．下面两幅图是单克隆抗体制备的示意图，请据图回答下列问题：
(1)图1和图2所示的过程中，都必须用到的动物细胞工程技术手段是什么？
提示：动物细胞培养(或动物细胞融合)。
(2)图2中受体细胞A代表的是什么细胞；B所示的细胞特点是什么？
提示：A代表的是浆细胞(效应B)；B所示细胞的特点是既能无限增殖，又能产生特异性抗体。
(3)图1中Ⅱ过程与植物原生质体融合的诱导不同之处是什么？Ⅱ过程的原理是什么？
提示：Ⅱ过程特有的诱导方法是利用灭活的病毒诱导；Ⅱ过程的原理是细胞膜的流动性。
单克隆抗体制备过程的关键分析
1．对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
2．杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。
3．制备单克隆抗体过程中的两次筛选
项目
第一次筛选
第二次筛选
筛选原因
诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选方法
用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
◎考法 考查动物细胞融合技术及单克隆抗体的制备
1．(2019·宁夏平罗中学第一次月考)类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫病，致残性强。研究表明，该病的病理与肿瘤坏死因子α(TNFα)密切相关，而一种人鼠嵌合的抗TNAα单克隆抗体能有效治疗RA。维持培养液如图为该单克隆抗体制备过程示意图。
(1)单克隆抗体的制备涉及细胞工程中的_____________________、________技术。
(2)图中的抗原A是__________，HAT培养基的作用是__________________。将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞具有的特点是_______________。
(3)医疗上，把单克隆抗体与化学药物或细胞毒素相结合制成“________”，借助抗体的定向作用将药物带到病变细胞并将其杀死。
(4)克隆动物是指用________方法得到的动物。
(5)单克隆抗体的特点是________、________、________。
解析：(1)单克隆抗体制备涉及动物细胞培养和动物细胞融合技术。(2)图中刺激免疫动物产生抗TNFα单克隆抗体的抗原是肿瘤坏死因子α(TNFα)。HAT培养基的作用是筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体。(3)医疗上，把单克隆抗体与化学药物或细胞毒素相结合制成“生物导弹”，借助抗体的定向作用将药物带到病变细胞并将其杀死。(4)克隆动物是指用核移植方法得到的动物。(5)单克隆抗体的特点是：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。
答案：(1)动物细胞融合(或杂交瘤) 动物细胞培养
(2)肿瘤坏死因子α(或TNFα) 筛选出杂交瘤细胞 既能大量增殖，又能产生特异性抗体
(3)生物导弹 (4)(动物体细胞)核移植
(5)特异性强 灵敏度高 并可能大量制备
[规律总结] 关于单克隆抗体制备的三个方面
1．杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。
2．进行动物细胞的诱导融合，形成的杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型。只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要用选择性培养基进行筛选。
3．获取单克隆抗体的场所
(1)若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则从培养液中提取。
(2)若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。
2．(2013·海南高考)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ)可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSVⅠ的单克隆抗体可快速检测HSVⅠ。
回答下列问题：
(1)在制备抗HSVⅠ的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSVⅠ蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了________反应，再从小鼠的________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是________________。
(2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的________中使其增殖，再从________中提取、纯化获得。
(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSVⅠ蛋白，其原因是该抗体具有________和________________等特性。
解析：(1)制备单克隆抗体时，需要先给小鼠注射特定抗原(HSVⅠ蛋白)，当小鼠血清中抗HSVⅠ蛋白的抗体检测呈阳性时，即该抗体与抗原HSVⅠ蛋白发生了特异性结合，此时的B淋巴细胞即为浆细胞，可从小鼠脾脏中获取B淋巴细胞，再将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经过筛选和克隆化培养，最终获得既能无限增殖又能产生专一抗体的杂交瘤细胞。
(2)单克隆抗体的获取途径有两条，其中一条是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖，再从腹水中提取、纯化获得。
(3)单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、纯度高等特性。
答案：(1)HSVⅠ蛋白 体液免疫 脾脏 骨髓瘤 无限增殖、产生专一抗体 (2)腹腔 腹水 (3)纯度高 特异性强、灵敏度高
真题体验| 感悟高考 淬炼考能
1．(2018·全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是____________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物，与核供体相比，其细胞的染色体数目不变。(2)由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，所以，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度明显低于体细胞核移植。(3)哺乳动物雌性和雄性个体的体细胞中常染色体数目相同，所以分别以雌性和雄性个体的体细胞为供体，克隆动物体细胞的常染色体数目相同，但其性染色体组合不同。
答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中 不变 (2)小于 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易 (3)相同 不同
2.(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
图1 图2
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体
转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)作为原料。
(3)①当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。
②对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP (3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C
3．(2014·全国卷Ⅰ改编)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。
回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有_______________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是__________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核。
(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是______________________________________________________________。
解析：(1)据图分析可知，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价几乎都达到16 000以上，小鼠Y的血清抗体的效价最高，最适合用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞的自身融合细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞。细胞的融合是随机的，并且不可能所有细胞都融合，故体系中会出现多种类型的细胞。(3)动物细胞融合后形成的是具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。(4)正常细胞的分裂次数是有限的，且经过免疫的B淋巴细胞高度分化，不能无限增殖，而是经多次传代培养后逐渐衰老死亡。
答案：(1)4 Y Y小鼠的血清抗体效价最高
(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% (3)1 (4)不能无限增殖
第2讲 细胞工程
[考纲展示] 1.植物的组织培养(Ⅱ) 2.动物细胞培养与体细胞克隆 (Ⅱ) 3.细胞融合与单克隆抗体 (Ⅱ)
考点一| 植物组织培养与植物体细胞杂交
1．细胞工程
(1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。
(2)目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。
(3)类型：根据操作对象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程。
2．植物组织培养技术
(1)概念理解
①培养对象：离体的植物组织、器官、细胞或原生质体。
②培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关激素等人工控制条件。
③培养结果：产生部分或完整植株。
(2)理论基础：植物细胞的全能性。
①含义：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。
②物质基础：细胞内含有本物种全部的遗传信息。
(3)填写操作过程图
―→
图中①表示脱分化，②表示再分化，A表示愈伤组织，B表示丛芽或胚状体。
3．植物体细胞杂交技术
(1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
(2)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。
(3)过程
(4)意义：克服不同种生物远缘杂交不亲和的障碍、获得杂种植株。
4．植物细胞工程的实际应用
(1)植物繁殖的新途径
①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。
②作物脱毒：选取作物茎尖、根尖等无毒组织进行组织培养，获得脱毒苗的技术。
③人工种子：胚状体等外包裹人工薄膜得到的种子，可以解决某些植物结实率低、繁殖困难的问题。
(2)作物新品种的培育：单倍体育种和突变体的利用。
(3)细胞产物的工厂化生产：即利用植物组织培养技术生产蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料和生物碱等。
[思考回答]
1．通过植物体细胞杂交形成的杂交植株是否一定可育？
提示：是否可育看同源染色体能否正常联会。若植物体细胞杂交过程得到的杂种植物存在同源染色体，能正常联会，则可育。
2．如图表示植物分化、脱分化和再分化过程及其关系。试回答相关问题：
(1)脱分化形成的愈伤组织细胞与正常体细胞相比，前者在结构的特点是什么？
提示：高度液泡化、无定形、细胞壁薄。
(2)经脱分化形成愈伤组织为什么需要避光培养？
提示：避光的作用是为了愈伤组织的形成，若给予光照，则会不同程度的形成维管组织(处于已分化状态)，就不能继续分化，造成组织培养失败。
(3)利用紫草细胞脱分化形成的愈伤组织细胞进行培养提取紫草素，与常规的从植物体内提取具有的明显优点有哪些？(至少答出三点)
提示：可以克服地理、气候等植物生长环境条件的限制，实现工业化、自动化生产；产量大、纯度高。
(4)从分化、脱分化和再分化的结果看，它们的实质都是什么？
提示：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。
1．细胞全能性
(1)原理：细胞内含有本物种全部的遗传信息。
(2)体内细胞全能性不表达的原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达。
(3)细胞全能性表达的条件：具完整细胞结构，离体，无菌，一定的营养、激素和其他适宜的外界条件。
(4)细胞全能性大小与细胞分化程度成反比。
2．激素比例与细胞分裂分化的关系
(1)适当提高生长素与细胞分裂素的比例容易生根。
(2)适当提高细胞分裂素与生长素的比例容易生芽。
(3)比例适中诱导产生愈伤组织。如图所示：
3．对不同物种植物体细胞杂交和有性杂交的比较
(1)结果不同
①体细胞杂交：不管染色体数、基因组还是染色体组都采用直接相加。
②植物有性杂交：先减半再相加。
(2)适用的定律不同
①有性生殖过程中符合孟德尔遗传定律。
②植物体细胞杂交：属于无性生殖，不符合孟德尔遗传定律。
◎考法1 考查植物组织培养过程分析
1．(2017·海南高考)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。回答下列问题：
(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是______________________。
(2)甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到______________。若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是____________________(填“具有完整的细胞核” “具有叶绿体”或“已转入抗性基因”)。
(3)图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是________________。A中的愈伤组织是叶肉细胞经________形成的。
(4)若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，________(填“能”或“不能”)采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)外植体在一定条件下进行组织培养获得试管苗的原理是植物细胞的全能性。
(2)蔗糖水解后可得到一分子的葡萄糖和一分子果糖；若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是应该具备整套遗传物质，即具有完整的细胞核。
(3)在植物组织培养过程中加入的细胞分裂素、生长素的比例不同，诱导形成的器官不同；外植体经脱分化形成愈伤组织，再分化形成完整的植株。
(4)依题意不能采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到的花卉基因型不同于原植株。
答案：(1)植物细胞的全能性 (2)葡萄糖、果糖 具有完整的细胞核 (3)细胞分裂素、生长素 脱分化 (4)不能 对杂合体的植株来说，其体细胞的基因型相同，而花粉粒的基因型与体细胞的基因型不同，用花粉粒进行组织培养得到花卉基因型不同于原植株
◎考法2 考查植物细胞工程技术及应用
2．甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。
回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的 ________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成 ________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为____________________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的 ______________________________________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
解析：(1)植物体细胞杂交的过程包括植物细胞融合和植物组织培养，其过程依次为酶解法去除植物细胞的细胞壁、用物理或化学法诱导原生质体融合、杂种细胞再生出细胞壁、杂种细胞经植物组织培养(脱分化形成愈伤组织，再分化形成幼根和芽进而形成完整植株)培育成完整植株。其中，酶解法去除植物细胞的细胞壁利用了酶的专一性，选择纤维素酶和果胶酶，水解植物细胞的细胞壁的主要成分——纤维素和果胶，暴露出有活力的原生质体。(2)多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上的染色体组的个体。甲和乙均为二倍体植物，假设二者有性杂交的后代不可育，其原因是该后代在进行减数第一次分裂过程中，由于没有同源染色体，联会出现紊乱，不能产生可育的配子。而植物体细胞杂交产生的杂种植株，细胞内含有原物种体细胞内的染色体，在减数第一次分裂过程中能够进行同源染色体配对，产生可育的配子。(3)经植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等，用人工薄膜包装后可得到人工种子。
答案：(1)纤维素 果胶 原生质体 愈伤 再分化(或分化) 植物体细胞杂交技术 (2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体(其他合理答案也可以) 在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常(其他合理答案也可以) (3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一个即可)
3．回答下列有关植物细胞工程应用有关的问题：
(1)植物细胞工程可用于培养脱毒苗，这一方法的原理是__________________，所以再生的植株可能不带病毒。
(2)微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗________，而与________配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要适宜的生长调节剂是________(填“脱落酸”或“2，4D”)。
(3)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)利用茎尖等分生部位进行组织培养获得脱毒苗的原理是植物体细胞具有全能性。
(2)适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗生根。微型繁殖培养基中使用的生长素与细胞分裂素比例不同，可以分别诱导根、芽的形成。使用高浓度的植物生长素类似物(如2，4D)可以抑制试管苗的生长。
(3)由蔗糖浓度下降可知，外植体离体培养过程中需要消耗蔗糖，12天后蔗糖浓度变化不大；pH下降会影响酶的活性，愈伤组织细胞不能进行光合作用，对物质的合成小于分解，故细胞干重下降。
答案：(1)植物细胞的全能性 (2)生根 细胞分裂素 2，4D (3)蔗糖浓度下降，pH降低考点二| 动物细胞与组织培养和核移植技术
1．动物细胞与组织培养
(1)过程
(2)动物细胞培养与动物组织培养的主要区别：动物细胞培养过程需用胰蛋白酶等处理组织块，以使细胞离散，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。
(3)培养条件
①环境条件：无菌、温度适宜和营养充足、pH适宜等。
②培养基种类
a．天然培养基：主要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，其特点是营养价值高、成分复杂。
b．合成培养基：人工配制的，其成分明确，便于控制实验条件，使用时需加入动物血清。
(4)培养类型
①原代培养：从供体获取组织或细胞后的初次培养。
②传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养，培养代数一般在10～50代左右。
2．动物体细胞核移植技术
(1)动物体细胞核移植技术的过程
重组细胞胚胎代孕母体―→生出与细胞核供体遗传性状基本相同的个体
(2)原理：动物体细胞核具有全能性。
(3)应用
①生产医用蛋白。
②作为异种移植的供体。
③了解胚胎发育及人体衰老的过程
④追踪和研究疾病的发展过程以便更有效地治疗疾病。
3．体细胞克隆
(1)克隆不仅仅是指无性繁殖，还包括遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。
(2)体细胞克隆是指用体细胞核移植技术进行的克隆。
(3)克隆技术意义：在克服动物种间杂交繁殖障碍、创造新物种方面具有重要的科学意义和潜在的经济价值。
(4)应用
①加速家畜遗传改良进程，促进优良育群的繁育。
②保护濒危物种。
[思考回答]
1．动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用有何不同？
提示：第一次使用胰蛋白酶处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次用胰蛋白酶的目的是使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来，分散成单个细胞。
2．动物细胞工程技术推动了免疫学和畜牧业的发展。如图为通过体细胞核移植过程得到克隆牛的流程图。
→→→犊牛
(1)与去核卵母细胞融合的供体高产奶牛细胞培养一般不会超过10代，原因是什么？
提示：保持细胞正常的二倍体核型。
(2)动物体细胞核移植的难度高于胚胎细胞核移植的原因是什么？
提示：动物胚胎的细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难。
(3)在现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟体细胞，直接培养成一个新个体，而是将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，你认为最可能的原因是什么？
提示：卵细胞的细胞质可使体细胞核的全能性得到表达。
1．动物细胞培养和核移植时注意的五个问题
(1)在分散细胞时，需用胰蛋白酶分散细胞，不能用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.8，胰蛋白酶作用的适宜pH为7.2～7.8，而多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4。
(2)取供体动物的体细胞培养，一般选用10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。
(3)克隆动物是由重组的细胞经培养而来的，该重组细胞的细胞质基因来源于受体细胞，细胞核基因来源于提供细胞核的亲本，其遗传物质来自两个亲本。
(4)克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
(5)从生殖方式的角度看，动物体细胞核移植技术(克隆)属无性生殖，重组细胞相当于受精卵，需要动物细胞培养和胚胎工程技术的支持。
2．动物细胞核移植的理解
(1)卵母细胞选择时期及原因：MⅡ中期的卵母细胞，此时具备受精能力，细胞质中合成与分裂、分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化，形成重组胚胎。
(2)选卵细胞作为受体细胞的原因
①卵细胞大，易于操作。
②卵黄多，营养丰富，为发育提供充足的营养。
③能激发重组细胞分裂分化。
(3)动物体细胞不能经培养直接发育成完整个体的原因：动物体细胞的全能性受到限制。
(4)该过程用到的技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养和胚胎移植。
◎考法1 考查动物细胞培养过程分析
1．某研究小组进行药物实验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为正常肝细胞，乙细胞为肝肿瘤细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)动物细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_________________________________________________________________。
(2)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同，一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。
(3)在两种细胞生长过程中，当甲细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物实验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更________。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用________消化处理。
(4)某研究小组研究了血清对正常细胞和癌细胞培养的影响，实验结果如图。
从该图提供的信息可以获得的正确结论有
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)动物细胞培养时加入含5%CO2的目的是为了维持培养液的pH。(2)已知甲细胞为正常肝细胞，乙细胞为肝肿瘤细胞。肝肿瘤细胞比正常肝细胞的分裂能力强，细胞周期短，因此在其他条件相同时，相同时间内肝肿瘤细胞产生的子代细胞多。(3)甲细胞为正常肝细胞，存在接触抑制，而乙细胞为肿瘤细胞，已经失去接触抑制现象，因此在这两种细胞生长过程中，当甲细胞铺满瓶壁时，其生长停止。乙细胞能无限增殖，因此其传代的次数比甲多；胰蛋白酶能消化组织细胞间的蛋白质，使组织细胞分散成单个细胞。(4)从图中曲线可看出培养基中有无血清对癌细胞的培养影响不大，即二者的细胞数在曲线上差别不大。正常细胞的培养过程中有血清的培养基在相同时间内培养得到的细胞数远远多于无血清的培养基所获得的细胞数。癌细胞培养与正常细胞培养二者的差距比较大，正常细胞达到一定的数目后不再增加，而癌细胞却能不断增加。
答案：(1)维持培养液的pH (2)少 (3)停止 少 胰蛋白酶 (4)①有无血清对正常细胞培养的影响不同；②培养基中补充血清有助于正常细胞的培养；③培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大
◎考法2 考查细胞核移植技术及应用
2．(2016·全国卷Ⅱ)如图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1)图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用________的方法。②代表的过程是________。
(2)经过多次传代后，供体细胞中________的稳定性会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
(3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(4)与克隆羊“多莉(利)”培育成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
解析：(1)哺乳动物的正常细胞核中性染色体的组成为XX(雌性)或XY(雄性)。卵母细胞在培养至减数第二次分裂的中期时，常采用显微操作法去除细胞核。②过程是将早期胚胎移植到代孕个体的子宫中，即代表的是胚胎移植。(2)一般来说，动物细胞在传代培养到10～50代时，部分细胞的细胞核型可能会发生变化，即遗传物质的稳定性会降低。因此，选材时一般选10代以内的细胞，以保证细胞正常的二倍体核型。(3)获得的克隆动物性状与供体动物基本相同，但不完全相同，从遗传物质的角度分析，性状不完全相同的原因是：克隆动物细胞质中的遗传物质来自去核卵母细胞的细胞质，细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响。(4)高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，但其细胞核的全能性在卵母细胞细胞质中的物质的作用下仍能得以表达。故克隆羊“多莉(利)”以及其他克隆动物的培育成功，证明了高度分化的动物体细胞的细胞核仍具有全能性。
答案：(1)XX或XY 显微操作 胚胎移植 (2)遗传物质 (3)卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
[误区警示] 动物细胞核移植技术中的3个易错点
1．动物细胞核移植技术，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
2．克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
3．核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同的原因：(1)克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但其线粒体中的DNA来自去核卵(母)细胞。(2)性状受基因与环境共同影响。(3)在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。
考点三| 动物细胞融合与单克隆抗体
1．动物细胞融合
(1)概念：在一定条件下将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程。
(2)原理：细胞膜的流动性。
(3)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电刺激等。
(4)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2．单克隆抗体制备
(1)单克隆抗体制备过程
(2)单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备。
[思考回答]
1．若仅考虑细胞的两两融合，B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后产生的细胞有3种类型，原因是什么？
提示：出现不同种类型是因为细胞融合是随机的。
2．下面两幅图是单克隆抗体制备的示意图，请据图回答下列问题：
(1)图1和图2所示的过程中，都必须用到的动物细胞工程技术手段是什么？
提示：动物细胞培养(或动物细胞融合)。
(2)图2中受体细胞A代表的是什么细胞；B所示的细胞特点是什么？
提示：A代表的是浆细胞(效应B)；B所示细胞的特点是既能无限增殖，又能产生特异性抗体。
(3)图1中Ⅱ过程与植物原生质体融合的诱导不同之处是什么？Ⅱ过程的原理是什么？
提示：Ⅱ过程特有的诱导方法是利用灭活的病毒诱导；Ⅱ过程的原理是细胞膜的流动性。
单克隆抗体制备过程的关键分析
1．对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。
2．杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。
3．制备单克隆抗体过程中的两次筛选
项目
第一次筛选
第二次筛选
筛选原因
诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选方法
用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
◎考法 考查动物细胞融合技术及单克隆抗体的制备
1．(2019·宁夏平罗中学第一次月考)类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫病，致残性强。研究表明，该病的病理与肿瘤坏死因子α(TNFα)密切相关，而一种人鼠嵌合的抗TNAα单克隆抗体能有效治疗RA。维持培养液如图为该单克隆抗体制备过程示意图。
(1)单克隆抗体的制备涉及细胞工程中的_____________________、________技术。
(2)图中的抗原A是__________，HAT培养基的作用是__________________。将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞具有的特点是_______________。
(3)医疗上，把单克隆抗体与化学药物或细胞毒素相结合制成“________”，借助抗体的定向作用将药物带到病变细胞并将其杀死。
(4)克隆动物是指用________方法得到的动物。
(5)单克隆抗体的特点是________、________、________。
解析：(1)单克隆抗体制备涉及动物细胞培养和动物细胞融合技术。(2)图中刺激免疫动物产生抗TNFα单克隆抗体的抗原是肿瘤坏死因子α(TNFα)。HAT培养基的作用是筛选出杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体。(3)医疗上，把单克隆抗体与化学药物或细胞毒素相结合制成“生物导弹”，借助抗体的定向作用将药物带到病变细胞并将其杀死。(4)克隆动物是指用核移植方法得到的动物。(5)单克隆抗体的特点是：特异性强、灵敏度高，并可能大量制备。
答案：(1)动物细胞融合(或杂交瘤) 动物细胞培养
(2)肿瘤坏死因子α(或TNFα) 筛选出杂交瘤细胞 既能大量增殖，又能产生特异性抗体
(3)生物导弹 (4)(动物体细胞)核移植
(5)特异性强 灵敏度高 并可能大量制备
[规律总结] 关于单克隆抗体制备的三个方面
1．杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。
2．进行动物细胞的诱导融合，形成的杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型。只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要用选择性培养基进行筛选。
3．获取单克隆抗体的场所
(1)若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则从培养液中提取。
(2)若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。
2．(2013·海南高考)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ)可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSVⅠ的单克隆抗体可快速检测HSVⅠ。
回答下列问题：
(1)在制备抗HSVⅠ的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSVⅠ蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了________反应，再从小鼠的________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是________________。
(2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的________中使其增殖，再从________中提取、纯化获得。
(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSVⅠ蛋白，其原因是该抗体具有________和________________等特性。
解析：(1)制备单克隆抗体时，需要先给小鼠注射特定抗原(HSVⅠ蛋白)，当小鼠血清中抗HSVⅠ蛋白的抗体检测呈阳性时，即该抗体与抗原HSVⅠ蛋白发生了特异性结合，此时的B淋巴细胞即为浆细胞，可从小鼠脾脏中获取B淋巴细胞，再将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经过筛选和克隆化培养，最终获得既能无限增殖又能产生专一抗体的杂交瘤细胞。
(2)单克隆抗体的获取途径有两条，其中一条是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖，再从腹水中提取、纯化获得。
(3)单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、纯度高等特性。
答案：(1)HSVⅠ蛋白 体液免疫 脾脏 骨髓瘤 无限增殖、产生专一抗体 (2)腹腔 腹水 (3)纯度高 特异性强、灵敏度高
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1．(2018·全国卷Ⅲ)2018年《细胞》期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴——“中中”和“华华”。回答下列问题：
(1)“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_______________________________。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目________(填“减半”“加倍”或“不变”)。
(2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度________(填“大于”或“小于”)体细胞核移植，其原因是____________________________________。
(3)在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目________(填“相同”或“不同”)，性染色体组合________(填“相同”或“不同”)。
解析：(1)动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物，与核供体相比，其细胞的染色体数目不变。(2)由于动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，所以，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度明显低于体细胞核移植。(3)哺乳动物雌性和雄性个体的体细胞中常染色体数目相同，所以分别以雌性和雄性个体的体细胞为供体，克隆动物体细胞的常染色体数目相同，但其性染色体组合不同。
答案：(1)将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞中 不变 (2)小于 胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易 (3)相同 不同
2.(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
图1 图2
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体
转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：(1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)作为原料。
(3)①当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。
②对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案：(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP (3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C
3．(2014·全国卷Ⅰ改编)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如图所示。
若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。
回答下列问题：
(1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是________________________________。
(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有_______________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是__________________________。
(3)杂交瘤细胞中有________个细胞核。
(4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因是______________________________________________________________。
解析：(1)据图分析可知，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗体效价几乎都达到16 000以上，小鼠Y的血清抗体的效价最高，最适合用于制备单克隆抗体。(2)融合体系中除了未融合的细胞和杂交瘤细胞之外，还有骨髓瘤细胞的自身融合细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞。细胞的融合是随机的，并且不可能所有细胞都融合，故体系中会出现多种类型的细胞。(3)动物细胞融合后形成的是具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。(4)正常细胞的分裂次数是有限的，且经过免疫的B淋巴细胞高度分化，不能无限增殖，而是经多次传代培养后逐渐衰老死亡。
答案：(1)4 Y Y小鼠的血清抗体效价最高
(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% (3)1 (4)不能无限增殖
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