备课素材知识点：细胞培养的常见污染类型 高中生物人教版选择性必修3

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微生物对细胞的影响因污染物和细胞种类的不同而表现各异，一般当污染物持续存在时，轻者细胞增殖生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，轮廓折光增强；重者细胞停止增殖，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或从瓶壁脱落。
若发生微生物污染，一般应及时将被污染的培养物及相关试剂在灭菌后按正规程序丢弃，与被污染培养物接触过的器材也应及时消毒灭菌，防止污染的再次发生。微生物污染的消除非常困难，且应保持隔离并严密监控，因此不要轻易尝试消除污染，除非细胞至关重要且不可替代。由此可见微生物污染的预防十分重要。为此，首先介绍如何判断常见的污染。
常见污染细胞的微生物有细菌、真菌、支原体、病毒等，不同污染物对细胞的影响有区别，真菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内（如48 h）压制细胞生长或产生有毒物质，而支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的。细菌、真菌的污染可通过肉眼和常规显微镜观察到，支原体、病毒污染的确定则一般需借助其他检测方法。
㈠细菌污染
细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5 μm，长度约0.5 ~ 5 μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分类方式繁殖和水生性较强的原核微生物。细菌增殖速度很快，能短时间在培养系统内产生大量细菌，从而导致培养基浑浊（有时静置的培养基初看不浑浊，但稍加振荡，就有很多浑浊物漂起；有时在培养基表面会出现轻微的薄膜或泡沫，或在培养物生长表面出现点状物，移动培养器皿时则消散）并变为黄色（细菌污染后大多能改变培养基pH）。用倒置相差显微镜观察，视野内可见点状的细菌颗粒，并可能出现由细菌迁移引起的闪动，一些细菌会成团或结合培养的细胞。
在细菌污染初期，若使用了抗生素，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒置相差显微镜也不易观察、判断，此时若怀疑有细菌污染，可用无抗生素的培养液常规培养观察。若未使用抗生素，培养液改变不明显，但又疑有污染，可取一份培养基样本接种到营养琼脂培养检测。
需注意细菌污染有时可能会和培养基组分的沉淀或细胞碎片混淆，但细菌形态一致，而沉淀或碎片则形态不同，并且通常大小不一；细菌团可能与沉淀的蛋白质混淆，但细菌团内可见很多单个或成串的细菌（特别是晃动后），蛋白质沉淀则不然。
细菌数量较多时会使原先清晰的培养背景变得模糊，甚至覆盖培养物，对培养物的生存构成直接的威胁。迅速增殖的细菌，会消耗营养液和产生毒素从而抑制细胞生长，毒性大的细菌会很快导致细胞崩解死亡。
㈡支原体污染
支原体是介于细菌和病毒之间能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态多变，大小介于0.2 ~ 2 μm之间，多吸附在细胞表面或散在于细胞之间。不同支原体的生物学性状有很大差别，一般对热敏感，对青霉素普遍有抗药性。由于支原体无致死细胞毒性且可与细胞长期共存，故培养基一般不发生浑浊，无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。除了细胞培养状况不佳，采用常规显微镜并不容易观察支原体污染，其检出需借助荧光染色、PCR、ELISA、免疫染色、放射自显影术、微生物学分析等方法，其中采用核酸荧光染料进行DNA染色是最简单和最可信的方法之一。
当进行荧光染色时，在40×或100×物镜下支原体可被显示为细胞质上明确的微粒或丝状染色，一般大小、性质一致，此时同样被亮染的培养细胞的细胞核可作为阳性对照。确定是否存在支原体污染需尽可能多地观察染色样本，因为不是所有培养的细胞都会被污染。
用荧光染色法进行支原体检测时，培养物的细胞碎片可能会造成假阳性结果，但细胞碎片不会出现清晰的点状或丝状支原体形态。若仍不能确认，可吸取适量待检培养基与指示细胞（为已明确无支原体污染且是支原体的适宜宿主，同时生长良好，有足够的细胞质以显示粘附的支原体，如MDCK细胞）共培养，然后荧光染色来观察指示细胞表面是否有支原体，从而避免误判。
运用荧光染色法有时会观察到细胞质存在均匀亮染，这可能是由RNA引起的，这类荧光会逐渐变暗，可将染色样本干燥避光保存后在第2天观察。如果对荧光检测的结果存在怀疑，可重复检测或采用其他方法再次检测。
支原体可黏附在宿主细胞表面，从细胞膜获取脂质和胆固醇，造成细胞膜损伤。支原体能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞抗原性，导致染色体畸变，干扰病毒复制以及具有类似病毒的作用。不同细胞对支原体的感受性和反应存在差异。
急性支原体污染可能会引起培养细胞状况的全面恶化，但很多支原体生长缓慢且不破坏宿主细胞（特别是连续培养的细胞株），它们可通过很多不同的途径改变培养物的行为和代谢。若细胞被支原体长期污染，会出现增殖减慢、饱和密度下降等，污染严重的情况下细胞会从培养器皿脱落，另外悬浮培养的细胞还会出现凝集现象。
㈢真菌污染
真菌是一类低等的真核生物，无法进行光合作用，以孢子进行繁殖，一般有发达的菌丝体，异养吸收型，陆生性较强。真菌种类繁多，形态各异，若发生真菌污染，大多肉眼可见白色或浅黄色小点漂浮于培养基表面，短期内培养基多不浑浊，某些真菌污染会导致培养基的pH升高；显微镜下观察，可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横于细胞之间，悬浮在培养液之中，有时还会产生孢子团，酵母菌和念珠菌则表现为独立的卵圆形颗粒，并可能出芽。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀死细胞，且会在培养板孔间蔓延而很快波及邻孔。
㈣病毒污染
病毒为一种大小以纳米计、不能独立地利用外界营养物质进行自体繁殖的微生物。病毒种类复杂，相应宿主细胞有特异性，而感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性改变，因此仅靠目测或显微镜观察不能达到检测目的。应根据不同的病毒选用不同的方法来检测，常规有红细胞吸附试验、动物接种检查、电子显微镜检查、免疫学检测和PCR等，因属病毒学的研究范畴，普通实验室不易推广。病毒进入细胞后，可改变培养物的生物学性状，影响培养细胞的生长或干扰实验结果的客观性。
为杜绝上述污染，可从以下几个方面做好预防工作：
（1）培养环境：
1）无菌室：保持清洁，经常擦洗，使污染物不易积聚。
2）超净台：①定期维护和保养，按厂家规定定期清洗和更换空气滤器，经常保持清洁并用75%乙醇消毒；②操作前提前30 min启动超净台紫外灯消毒；③存放的物品应全面消毒，并尽可能只将立即使用的物品放入；④细胞培养操作时应尽量保持层流，避免气雾状污染物进入培养器皿；⑤操作中溅出的液体应及时擦去，并用75%乙醇擦拭消毒；⑥实验完毕后，移走所有物品，并彻底用75%乙醇擦洗工作台。
3）二氧化碳培养箱：①由于箱内潮湿，温度适宜，有利于微生物生长，故应定期对培养箱进行清洁和消毒处理。将隔板、水盘和可拆卸部分取出，按去污剂擦洗、清水冲洗、消毒剂擦洗、紫外线照射30min的顺序处理，然后放回箱内；②水盘内使用灭菌蒸馏水或添加真菌抑制剂如硫酸铜（会腐蚀不锈钢等材质的水盘）或专用灭菌水，并注意及时更换新鲜水；③尽量减少开门次数，降低污染机会；④若取存细胞时不慎将培养液漏出，经及时用75%乙醇擦拭消毒。
（2）物品的消毒灭菌：①操作前应做好所用器皿、试剂的消毒灭菌工作；②高压蒸汽灭菌是最常用的方法，不能采用此法灭菌的器皿、试剂，应采用其他消毒灭菌方法，如培养基等试剂可过滤除菌，盖玻片等器械可用75%乙醇浸泡消毒后置于无菌环境中晾干；③若物品消毒灭菌后长时间未使用，应重新处理。
（3）个人卫生：操作前洗净双手，操作时穿清洁的长外衣，同时佩戴无菌的手套、口罩和帽子，手套经常用75%乙醇擦拭消毒。
（4）无菌操作：防止污染的关键在于严格无菌操作。无菌意识不强、动作不准确、操作不熟练等都会造成污染。注意事项主要如下：①细胞培养的操作一定要在超净台等层流装置内进行，无菌的试剂、器械一定要在无菌区开封；②操作时减少交谈、咳嗽等防止来自唾沫和呼出气流造成的污染；③培养试剂不宜过早开瓶，操作时应尽可能保持瓶体倾斜，所有瓶口不能与超净台的风向相逆，使用后应立即封闭瓶口；④培养的细胞处理前也不要过早暴露于空气中；⑤不要在打开器皿上方操作；⑥不允许用手触及器皿的无菌部分（如瓶口、瓶盖内侧）；⑦吸取液体时应专管专用，及时替换；⑧若无菌器物的尖端接触到非无菌物品表面，应及时更换；⑨为确保培养物的安全，应尽早冻存有价值的培养物；⑩对新引进的细胞株、血清等生物材料应先隔离培养观察，防止外来的污染源。
（5）抗生素：没有哪种抗生素都能抑制所有微生物，即使联合使用也难以根除污染。抗生素对细胞生长有一定影响，由抑菌引起的共生现象亦可导致实验假象；持续使用会导致慢性微生物污染（在这种情况下，微生物被抗生素抑制，但没有被杀死，它们会在培养体系中存留，大部分时间检测不到，但当条件改变时会再次出现），同时还会使微生物产生抗药性的几率大大增加，因此其使用需谨慎，不要让培养物长期处于抗生素中。只要操作与条件合格，最好不添加。