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新高考生物一轮复习课件 第十单元 第4课 基 因 工 程（含解析）
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这是一份新高考生物一轮复习课件 第十单元 第4课 基 因 工 程（含解析），共60页。PPT课件主要包含了核心概念·自查，目的基因，分子水平，核苷酸序列，二酯键，黏性末端，2DNA连接酶，一个至多个，受体细胞，编码蛋白质等内容，欢迎下载使用。
第4课 基 因 工 程
核心概念·自查
【概念导图】 一图知全局
【概念梳理】 闭书测基础一、基因工程1.概念：
目的基因
体外
分子水平
定向
2.基本工具：(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)。①本质：蛋白质。②来源：主要是从_____生物中分离纯化出来的。③作用：识别特定的___________并切开特定部位的两个核苷酸之间的____________。
原核
核苷酸序列
磷酸
二酯键
④结果：产生_________或平末端，图示：
黏性末端
(2)DNA连接酶：
(3)载体。①种类：_____、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②特点和意义：
质粒
一个至多个
标记
③作用。a.作为运载工具，将_________转移到受体细胞内。b.利用它在_________内对目的基因进行大量复制。
目的基因
受体细胞
3.基本操作程序：(1)目的基因的获取：①目的基因：主要是指___________的基因，也可以是一些具有_____作用的因子。②获取目的基因的方法。b.利用PCR技术扩增目的基因。
编码蛋白质
调控
c.用化学方法人工合成：
核苷酸序列
DNA合成仪
反转录酶
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心：①基因表达载体的组成及作用：
②构建过程：
(3)将目的基因导入受体细胞“三种类型”比较：
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
Ti质粒的T-DNA上
染色体的DNA上
显微注射
新性状
感受态
感受态细胞
(4)目的基因的检测与鉴定的“两个水平”：
二、蛋白质工程1.流程图。A._____，B._____，C._________，D._______，E._________。2.手段：_________或_________。3.结果：改造了现有蛋白质或制造出___________。4.应用：主要集中应用于对___________进行改造，改良生物性状。
转录
翻译
分子设计
多肽链
预期功能
基因修饰
基因合成
新的蛋白质
现有蛋白质
【概念辨析】 全面清障碍1.判断下列有关基因工程工具叙述的正误：(1)限制酶只能用于切割目的基因。 ( )分析：限制酶既能用于切割目的基因，也能用于切割载体，并且一般用同一种限制酶切割目的基因和载体。(2)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。( )分析：质粒是基因工程中常用的工具而不是工具酶。
×
×
(3)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 ( )分析：E·coliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端。(4)限制酶也可以识别和切割RNA。 ( )分析：限制酶又称限制性核酸内切酶，专一对DNA起作用。
×
×
2.判断下列基因工程的基本操作程序叙述的正误：(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因。 ( )分析：目的基因大多是编码蛋白质的基因，少数是具有调控作用的因子，如启动子、终止子等。(2)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )(3)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达。 ( )分析：应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在以及是否转录，但不能确定目的基因是否指导合成了抗冻蛋白。
×
√
×
3.判断下列有关基因工程的应用及蛋白质工程叙述的正误：(1)转基因抗虫植物一定能抗病。 ( )分析：植物病症由细菌、病毒等引起，抗虫植物不一定抗病。(2)转基因抗病农作物不需要使用农药。 ( )分析：转基因抗病农作物只能抵抗某种病原体，可以减少农药的使用量。(3)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 ( )分析：蛋白质分子不能复制，蛋白质工程应对基因进行操作。(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 ( )
×
×
×
√
【概念活用】 教材命题源教材选修3 P5 图1-3：
分析图可知，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是_______，切割位点在G和A之间，切开G和A之间的___________；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是_______，切割位点在_____之间，切开的是G和C之间的磷酸二酯键。
GAATTC
磷酸二酯键
CCCGGG
C和G
教材选修3 P10“生物技术资料卡”：cDNA文库如何建成？为什么不含有启动子和内含子？提示：cDNA文库是以某一发育时期细胞中的mRNA为模板反转录形成的。mRNA中不含有启动子和内含子对应的碱基序列，故cDNA文库不含启动子和内含子。
关键能力·进阶
考点一 基因工程的工具 【典例精研引领】(2020·北京高考)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。(1)纤维素属于______糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是____________。
(2)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。(3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________。
(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。(举一例)
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。(2)由于密码子具有简并性，所以即使克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。(3)根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamHⅠ进行切割，而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。(4)本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，对照组2的处理是直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶(C1酶)。(5)该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
答案：(1)多 葡萄糖 (2)密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸(3)BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)(4)向培养基中接种纤维素酶(C1酶) (5)降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【母题变式延伸】核心素养新命题(1)为使获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，除用同一种限制酶切割外，能否用其他酶切割？为什么？(科学思维：类比与推理，归纳与演绎)提示：可以。为使载体和目的基因相连，只要切出相同的黏性末端即可，可以是同一种酶，也可以是不同种酶。(2)克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部为什么不能有这两种酶切位点？提示：若该基因内部有这两种酶切位点，目的基因将会被切割，基因表达载体将会缺少完整的目的基因。
【知能素养提升】1.DNA连接酶和限制酶的关系：(科学思维：分析与综合)(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)DNA连接酶起作用时，区别于DNA聚合酶不需要模板。
2.与DNA相关的五种酶的比较：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 结合工具酶的使用，考查生命观念的结构与功能观1.(2021·南昌模拟)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是 ( )
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键C.图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物D.用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到7种产物
【解析】选D。酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；图1中酶用来切割DNA，DNA单链是脱氧核苷酸通过磷酸二酯键相连，因此酶催化反应的化学键是磷酸二酯键， B正确；分析图1，限制酶XhoⅠ有2处切割位点，切割后产生3个DNA片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，C正确；从图1可知，用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到6种产物，D错误。
2.在基因工程中，作为基因运输工具的载体，下列哪项不是载体必须具备的条件 ( )A.能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存B.具有一个至多个限制酶切割位点C.必须是细菌的质粒D.具有某些标记基因
【解析】选C。载体能在宿主细胞中复制并稳定保存，A正确；载体具有多个限制酶切割位点，以便于外源基因连接，B正确；最常用的载体是质粒，也可以是噬菌体、动植物病毒，C错误；载体除具有限制酶切割位点外必须含有标记基因，便于筛选，D正确。
【方法技巧】限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
考向二 通过载体的应用，考查生命观念的结构与功能观3.(2021·临沂模拟)基因工程中使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组质粒的构建和筛选。已知限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，据图分析错误的是 ( )
A.限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同B.用限制性核酸内切酶Ⅱ切割获得目的基因时，会有20个氢键发生断裂C.质粒只能用限制性核酸内切酶Ⅰ切割，目的基因可以只用限制性核酸内切酶Ⅱ切割D.选用限制酶切割目的基因时，只要目的基因两端的序列中含有该酶的识别序列即可
【解析】选D。据题可知，限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ虽然识别的序列不同，但切割后获得的黏性末端相同，A正确；GATC对应的DNA序列含有10个氢键，用限制性核酸内切酶Ⅱ切割获得目的基因时，目的基因两端均会形成GATC单链，会有20个氢键发生断裂，B正确；若用限制酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会被破坏，用限制酶Ⅰ切割目的基因不能获得目的基因，因此质粒用限制性核酸内切酶Ⅰ切割，目的基因用限制性核酸内切酶Ⅱ切割，C正确；选用限制酶切割目的基因时，除了目的基因两端的序列中含有该酶的识别序列，还要考虑与载体结合的问题，D错误。
4.(2021·河北模拟)基因和表达载体相连时既可以正向连接也可以反向连接。如图甲、乙分别表示某质粒、含目的基因和酶切位点的DNA片段，构建基因表达载体时应用酶B和酶C进行切割，不应用酶A切割运载体和DNA片段，其原因不包括 ( )
A.防止目的基因和载体发生反向连接B.保证构建的重组质粒中含有标记基因C.防止目的基因或载体重新自身环化D.保证构建的重组质粒中含有启动子
【解析】选D。质粒和含目的基因的DNA片段上都有酶B和酶C的酶切位点，酶B和酶C切割后产生的黏性末端不同，可以防止目的基因和载体发生反向连接，A正确；用酶B和酶C进行切割后，重组质粒中还含有氨苄青霉素抗性基因可作为标记基因，若用酶A切割，质粒中的两个标记基因都会被破坏，B正确；酶B和酶C切割后产生的黏性末端不同，可防止目的基因或载体重新自身环化，C正确；无论用哪种酶切都不会破坏质粒中的启动子，重组质粒中都含有启动子，D错误。
5.(2021年湖北适应性测试)某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：(1)双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5’端和3’端，从左到右的5’-3’DNA链是编码链，从左到右的3’-5’ DNA链是模板链。(2)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5’ATGGTGAGC……AAGTAA 3’。
(3)质粒载体中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ、和NotⅠ等酶的酶切位点(这些酶各自的识别序列不同)，如下图所示。
回答下列问题：(1)增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为___________。 (2)通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计______(填“一对”或“一个”)引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95 ℃热变性、55～60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是______和______。
(3) eGFP的PCR产物两端分别含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是____________(答一点即可)。 (4)将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个___________单菌落。
【解析】本题主要考查基因工程、PCR技术、微生物培养等知识的运用能力。(1)已知DNA编码序列为5’ATGGTGAGC……AAGTAA 3’，则其模板链应为3’TACCACTCG……TTCATT 5’，基因转录时，以DNA的模板链为模板，依据碱基互补原则合成一条mRNA链，故增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为5’AUGGUGAGC……AAGUAA 3’。(2)DNA有两条链，故利用PCR扩增目的基因时，应依据与目的基因碱基序列互补，设计一对引物；72 ℃延伸温度应考虑酶的活性以及利于模板与引物结合两个因素。(3)与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是目的基因和载体均可产生两个不同末端，可有
效防止目的基因自身环化(或防止目的基因与载体错误连接)。(4)卡那霉素抗性基因为标记基因，用于重组DNA的筛选与鉴定，若表达载体构建成功，表达载体含eGFP(绿色荧光蛋白)基因，故在含卡那霉素的培养基中存活下来并形成的菌落应该在自然光照下显示绿色。
答案： (1)5’AUGGUGAGC……AAGUAA 3 ’(2)一对 酶的活性 模板与引物结合(3)防止目的基因自身环化(或防止目的基因与载体错误连接)(4)绿色荧光
【知识总结】载体上标记基因及其作用原理(1)载体上的标记基因：一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。(2)作用原理：当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
【加固训练·拔高】1.(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是 。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有___________，不能表达的原因是 。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_______________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【解析】本题主要考查限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用及基因表达载体的构建。(1)BamHⅠ和Sau3AⅠ的共同识别序列是—GATC—，二者切割形成的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的前端，终止子应位于目的基因的后端，这样目的基因才能顺利地转录并完成翻译过程，即顺利表达，图中所示甲、丙均不符。(3)常见的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和E·coli DNA连接酶，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案亦可)(3)E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶
2.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________；并且________和_________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为：具有一个或多个限制酶切点；具有自我复制能力；带有标记基因；对宿主细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(3)噬菌体营寄生生活，能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素 (3)受体细胞
考点二 基因工程的基本操作程序【典例精研引领】(2021·宝鸡模拟)某种小麦具有极强的耐盐性，其耐盐性与小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因(耐盐基因)有关。科学家将该基因转移到水稻细胞中，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：(1)理论上基因组文库含有生物的______基因；而cDNA文库含有生物的______基因。 (2)若要从该种小麦中获得Na+/K+逆向转运蛋白基因，可首先建立该种植物的基因组文库，再从中____________出所需基因。
(3)将Na+/K+逆向转运蛋白基因导入水稻细胞中的常用方法是___________。 (4)为保证Na+/K+逆向转运蛋白基因(耐盐基因)在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的____________(填“复制原点”“启动子”或“标记基因”)。 (5)筛选出含有目的基因的水稻细胞，经过________过程，培养出愈伤组织，再诱导愈伤组织形成水稻幼苗。将转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中进行耐盐试验，用非转基因幼苗作对照，培养一个月后观察现象，若_________，则说明转基因植株获得了耐盐特性。
(6)假如用得到的二倍体转基因耐盐植株自交，子代中耐盐与不耐盐植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐盐基因整合到了_______________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)基因组文库含有某种生物的全部基因；cDNA文库中只含有该种生物的部分基因。(2)若要从该种小麦中获得Na+/K+逆向转运蛋白基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中筛选出所需的耐盐基因。(3)水稻是单子叶植物，基因表达载体导入水稻细胞常用基因枪法。(4)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。因此为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的启动子。
(5)愈伤组织是水稻细胞经过脱分化过程形成的。将转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养一个月后观察现象，若转基因植株获得了耐盐特性，则说明转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄)。(6)假如用得到的二倍体转基因耐盐植株自交，子代中耐盐与不耐盐植株的数量比为3∶1时，该比例符合杂合子自交后代的结果，则可推测该耐盐基因整合到了同源染色体的一条上。
答案：(1)全部 部分 (2)筛选 (3)基因枪法(4)启动子 (5)脱分化 转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄)(6)同源染色体的一条上
【母题变式延伸】核心素养新命题(1)Na+/K+逆向转运蛋白转运Na+/K+时，该物质以哪种方式进出细胞，为什么？(科学思维：分析与综合)提示：方式是主动运输， Na+/K+转运是逆浓度梯度。(2)科学家在将目的基因导入双子叶植物细胞时，常用的转化方法是什么？原理是什么？(生命观念：结构与功能观)提示：农杆菌转化法，植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，则目的基因将被一起带入)。
【备选典例】 (2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端，获得了L1-GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是___________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______，也是为了保证_____________。 (2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了______和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的____________移入牛的_______________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的___________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
【解析】(1)将甲插入质粒P0时，为了保证甲(L1-GFP融合基因)的完整性，应该选择E1和E4两种酶切割，并且把目的基因插入启动子和终止子之间，从而使其能在受体细胞中表达。(2)在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光表明基因已表达，而基因的表达包括转录和翻译两个过程。(3)由(4)题意可知，获得含有L1-GFP融合基因(甲)的牛为克隆牛，需要用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入去核卵母细胞中。(4)检测甲是否存在于牛的不同组织细胞中，可以采用PCR技术扩增，再用DNA分子杂交技术来检测，PCR技术中模板是DNA，并不是RNA。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译(3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
【知能素养提升】1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类：(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因。(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点。(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间。
cDNA文库与基因组文库的比较：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 结合目的基因的获取，考查比较与分类能力1.(2021·济宁模拟)利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如图所示。下列说法错误的是 ( )
A.cDNA文库的构建需要用到反转录酶B.cDNA文库的基因数目比基因组文库的基因数目少C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D.从该文库中可筛选到胰高血糖素基因
【解析】选D。cDNA是以mRNA为模板，经反转录酶催化形成的，故cDNA文库的构建需要用到反转录酶，A正确；由于cDNA文库中只含有一种生物的一部分基因，而基因组文库中含有一种生物的全部基因，故两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，B正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对，C正确；胰岛B细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛B细胞内提取不到胰高血糖素基因的mRNA，无法逆转录形成胰高血糖素基因的cDNA，故不能从利用人胰岛B细胞构建的cDNA文库中筛选到胰高血糖素基因，D错误。
2.(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括___________和________。 (2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是___________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。(2)体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键，DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90～95 ℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。 (3)由于在PCR过程中，需要不断地改变温度，该过程中涉及较高温度处理，大肠杆菌DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq酶催化。
答案：(1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
考向二 通过基因工程操作的基本程序，考查制订实施方案的能力3.(2021·北理工附中模拟)为增加玉米抗旱性，科研人员构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是 ( )A.提取该微生物mRNA反转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因B.将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌C.用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作D.用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状
【解析】选D。提取该微生物mRNA，在反转录酶的催化作用下，反转录为cDNA，再通过PCR可获得大量目的基因，A正确；农杆菌经钙离子处理后，成为感受态，使其易于吸收周围的DNA分子，所以将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌，B正确；用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作，防止杂菌污染，C正确；用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D错误。
4.(2021·汉中模拟)HIV(艾滋病病毒)为逆转录病毒，而逆转录酶缺乏校正修复功能，导致HIV的变异频率非常高。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重要手段之一。请根据相关知识回答下列问题：
(1)科学工作者利用转基因技术研制HIV疫苗取得了一定进展，如图是该技术的操作简要路径(①②③表示操作步骤)：图中②表示____________，目的基因的载体有___________(答出三种)，要检测目的基因是否插入酵母菌的DNA，可采用____________技术，利用探针检测酵母菌的基因，如果出现________，就表明目的基因已插入酵母菌DNA中。 (2)在基因工程中将重组质粒导入不同的受体细胞可采用不同的方法，若是导入植物细胞，采用最多的方法是___________，若是导入大肠杆菌，一般情况下，需要制备感受态细胞，原因是___________________________。
【解析】(1)基因工程的操作步骤：获取目的基因、基因表达载体的构建、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。图中②表示构建基因表达载体。在基因工程中使用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。要检测目的基因是否插入受体细胞内的DNA上，检测方法是采用DNA分子杂交技术，利用含有放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测受体细胞的基因，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入受体细胞DNA中。
(2)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，将质粒上的T-DNA转移到受体细胞。大肠杆菌属于微生物，由于未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱，作为受体细胞需要经过钙离子处理使其处于感受态，感受态细胞容易吸收周围环境中的DNA。
答案：(1)基因表达载体的构建 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等 DNA分子杂交 杂交带(2)农杆菌转化法 未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
【加固训练·拔高】1.(2020·江苏高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种___________酶，它通过识别特定的___________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化____________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是____________(从引物①②③④中选择，填编号)。
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____________。A.5'- AACTATGCG-------AGCCCTT-3'B.5'- AATTCCATG-------CTGAATT-3' C.5'- GCAATGCGT------TCGGGAA-3'D.5'- TTGATACGC------CGAGTAC-3'
【解析】本题主要考查PCR的过程和应用。(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
(3)引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列(2)磷酸二酯键 DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④ (4)B
2.(2021·赤峰模拟)斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，研究人员构建了HuC基因的表达载体，并导入斑马鱼细胞中研究其作用，请回答：
(1)为获取HuC基因，研究人员从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过___________________ 获得大量的DNA，进而构建出HuC基因的________。(2)DraⅢ，SnBⅠ等是质粒上不同限制酶的切割位点。为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的____________酶进行切割，这样做的原因是________________________。不选择NotⅠ酶切割的原因是________________________。 (3)用Ca2+处理大肠杆菌，大肠杆菌细胞即能够_________________。实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察___________或者在培养基中添加________，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
【解析】(1)从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过逆转录过程合成目的基因，并通过PCR技术在体外扩增可获得大量的目的基因，进而构建出HuC基因的cDNA文库。
(2)构建基因表达载体时，不能破坏运载体上的启动子、复制原点，以及运载体上需要保留的标记基因，为了防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，常用不同的限制酶切割质粒和目的基因，结合图示中各种限制酶的酶切位点可知，为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行切割。卡那霉素抗性基因为标记基因，若用NotⅠ酶切割，将会导致卡那霉素抗性基因被破坏，且切割后的质粒会失去启动子，使基因表达载体中缺少标记基因无法筛选，且没有启动子无法转录，所以不选择NotⅠ酶切割质粒。
(3)用Ca2+处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的DNA分子。由于绿色荧光蛋白表达后会发绿光，所以实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察表达的绿色荧光蛋白菌落或者在培养基中添加卡那霉素，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
答案：(1)逆转录和PCR技术扩增 cDNA文库(2)EcoRⅠ酶和BamHⅠ 可以防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接破坏标记基因无法筛选(且没有启动子) (3)吸收周围环境中的DNA分子 表达的绿色荧光蛋白菌落 卡那霉素
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程的崛起【典例精研引领】(2021·郑州模拟)X-连锁重症联合免疫缺陷是一种单基因遗传病，患者缺乏特异性免疫机能。研究人员尝试对20名患病儿童进行基因治疗。他们提取并培养患者的造血干细胞，然后利用逆转录病毒载体将正常基因插入细胞的染色体中，最后将改造后的造血干细胞移植给患者。这些患者的免疫缺陷被治愈了，但有5名儿童患了白血病。回答下列问题：
(1)逆转录病毒载体是对天然逆转录病毒改造获得的，改造时要破坏逆转录病毒的外壳蛋白基因等对细胞有害的基因，增加_____酶作用位点和____基因。(2)利用__________技术可以检测正常基因是否已成功插入细胞的染色体中。(3)研究人员在培养造血干细胞过程中，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中，CO2的主要作用是____________。培养过程中应定期更换培养液，目的是________________________________。 (4)与用捐赠者的造血干细胞进行移植相比，基因治疗的优点是__________。但基因治疗也有一定的风险，例如上文中患儿白血病的致病原因是_______。
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)作为运载体需要具备自我复制能力；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因等条件。依据题文可知，改造逆转录病毒基因时，需要增加限制酶作用位点和标记基因。(2)根据目的基因的检测和鉴定可知，检测正常基因是否已成功插入细胞的染色体中，应该用DNA分子杂交技术。(3)培养造血干细胞过程中，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中，CO2的主要作用是维持培养液的pH，从而为细胞内酶的活性提供适宜的pH条件。培养过程中应定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(4)基因治疗的优点是不会发生免疫排斥反应。癌变是原癌基因或抑癌基因突变的结果，题文中患儿白血病的致病原因是外源基因插入原癌基因(或抑癌基因)中导致基因突变从而发生细胞癌变。
答案：(1)限制 标记 (2) DNA分子杂交(3)维持培养液的pH 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害(4)不会发生免疫排斥 外源基因插入原癌基因(或抑癌基因)中导致细胞癌变
【母题变式延伸】 核心素养新命题(1)最常用的核酸探针是哪种？怎样制作？(生命观念：结构与功能观)提示：DNA探针；DNA探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，可用同位素进行标记。(2)为什么虽然基因治疗技术向人类展示了它奇妙的“魔术师”般的魅力，但也有大量的科学家对这种技术的发展表示出极大的担忧？(社会责任：关爱生命)提示：①安全问题；②体内表达基因的可控性问题；③外源基因不能在体内长期稳定表达；④目的基因转移效率不高；⑤基因治疗的复杂性问题；⑥基因治疗中靶细胞生物学特性改变的问题；⑦伦理方面的问题。
【知能素养提升】1.概念辨析：(生命观念：结构与功能观)(1)基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。(2)基因探针：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。(3)基因芯片：将数以万计、乃至百万计的基因探针有规律地排列在支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。(4)基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
2.比较基因治疗与基因诊断：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 利用基因工程在生产、生活中的应用，考查生命观念的结构与功能观和关爱生命的社会责任1.(2021·烟台模拟)帝王蝶的幼虫吃一种叫作“乳草”的有毒植物(乳草产生的毒素“强心甾”有能够结合并破坏动物细胞钠钾泵的功能)，而且还能将“强心甾”储存在体内以防御捕食者。研究人员发现帝王蝶的钠钾泵的119和122位氨基酸与其他昆虫不同。利用基因编辑技术修改果蝇钠钾泵基因，发现122位氨基酸改变使果蝇获得抗“强心甾”能力的同时导致果蝇“瘫痪”，119位氨基酸改变无表型效应，但能消除因122位氨基酸改变导致的“瘫痪”。根据以上信息可做出的判断是 ( )
A.帝王蝶在进化历程中119、122位氨基酸的改变一定是同时发生的B.帝王蝶钠钾泵突变基因是由于“强心甾”与钠钾泵结合后诱发突变形成的C.通过基因编辑技术研究果蝇钠钾泵基因功能时设置了三个实验组D.“强心甾”与钠钾泵结合的普通动物细胞，一般会因渗透压失衡而破裂
【解析】选C。利用果蝇为实验材料证明了第122位氨基酸改变使果蝇获得抗“强心甾”能力，但不能证明帝王蝶在进化历程中119、122位氨基酸的改变一定是同时发生的，A错误；“强心甾”与钠钾泵结合后，破坏了钠钾泵的结构，进而破坏了钠钾泵的功能，但不能推测出“强心甾”与钠钾泵结合后诱发基因突变的结论，B错误；由分析可知，通过基因编辑技术研究果蝇钠钾泵基因功能时设置了三个实验组，C正确；“强心甾”与钠钾泵结合会导致钠钾泵的功能被破坏，据此可推测“强心甾”能导致普通动物细胞兴奋传导异常，D错误。
2.(2021·日照模拟)基因编辑是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部片段，定点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传性改变的技术。如图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中用SgRNA指引核酸内切酶Cas9结合到特定的靶位点。下列分析不合理的是 ( )
A.图中B基因缺失一段核苷酸序列可能导致基因突变B.图中SgRNA1的碱基序列和SgRNA2碱基序列相同或互补C.Cas9可识别特定的核苷酸序列使核苷酸间的磷酸二酯键断裂D.根据上述处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能
【解析】选B。图中B基因缺失一段核苷酸序列可能导致基因突变，A正确；图中SgRNA1的碱基序列和SgRNA2碱基序列结合的是不同的DNA区段，故一般情况下二者既不相同也不互补，B错误；核酸内切酶Cas9可识别特定的核苷酸序列，并从特定的位点切割磷酸二酯键，C正确；通过破坏B基因前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能，D正确。
3.(2021·邯郸模拟)我国科学家目前正在探索培育过量表达蔗糖转运蛋白基因(TaSUT1A)的转基因小麦，通过分析TaSUT1A在转基因小麦中的遗传及其在抗干旱环境中的作用，选育抗旱的转基因小麦新品种。小麦属于单子叶植物，如图为基本技术流程示意图。请回答下列问题：
(1)为了大量扩增分离得到的TaSUT1A，一般采用的技术是___________，该技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是____________。(2)一般采用相同的_________切割目的基因片段与载体，原因是_________。(3)将构建好的基因表达载体导入小麦细胞常用________法，但成本较高；受体细胞经脱分化形成愈伤组织，脱分化是让已经分化的细胞经诱导后失去其___________________的过程。 (4)为了证明TaSUT1A是否表达，可以通过_____检测有无蔗糖转运蛋白生成，并通过与______中蔗糖转运蛋白含量的对比来确定TaSUT1A是否过量表达。
【解析】(1)为了大量扩增分离得到的TaSUT1A，一般采用的是PCR技术，该技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物。(2)一般采用相同的限制酶切割目的基因片段与载体，这样可获得相同的黏性末端，便于DNA连接酶连接。(3)将构建好的基因表达载体导入小麦细胞常用基因枪法。愈伤组织在结构形态上的特点是呈无固定形态的薄壁细胞。脱分化是让已经分化的细胞经诱导后失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。
(4)为了证明TaSUT1A是否表达，可以通过抗原-抗体杂交检测有无蔗糖转运蛋白生成，并通过与普通正常小麦中蔗糖转运蛋白含量的对比来确定TaSUT1A是否过量表达。
答案：(1)PCR技术 根据这一序列合成引物(2)限制性核酸内切酶(或限制酶) 获得相同的黏性末端(3)基因枪 特有的结构和功能而转变成未分化细胞(4)抗原-抗体杂交 普通正常小麦
【加固训练·拔高】1.(2021·滨州模拟)玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP(冷激蛋白)基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。
(1)研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知_______________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需____次扩增才能获得所需的ubi启动子。(2)图1所示的流程图中，过程①需_______________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插入部位为______。过程②需要用CaCl2溶液处理农杆菌，其目的是____________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含______的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。
(3)研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为 ________片段，实验结果表明__________________。(4)在个体水平上对转基因玉米植株进行________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。
【解析】(1)在利用PCR技术进行扩增时，需要事先设计引物，这里需要根据ubi启动子设计合适的引物，因此需已知ubi两端的一段序列，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需3次扩增才能获得引物之间的核苷酸序列，即至少需3次扩增才能获得所需的ubi启动子。
(2)图1中，过程①为载体和目的基因相连的过程，因此需限制酶和DNA连接酶的催化从而实现连接，在获得ubi-CSP基因构建表达载体时，需要将ubi-CSP基因插入T-DNA内部(且不破坏hpt)，这样能保证T-DNA转移时携带目的基因与玉米的染色体DNA连接。过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，因为处于感受态的农杆菌易于吸收外源DNA，过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含潮霉素的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经脱分化过程长成幼苗，从而获得了转基因玉米植株。
(3)图2所示为放射性检测结果，因此这里的基因探针为含放射性同位素标记的CSP基因片段，实验结果显示在第1、2、4、5株玉米中检测出目的基因的放射性，据此可知除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。(4)在个体水平上，可以通过对转基因玉米植株进行低温耐受性实验，进而检测CSP基因是否在玉米中成功表达。
答案：(1)ubi两端的一段序列 3(2)限制酶和DNA连接酶 T-DNA内部(且不破坏hpt) 获得感受态细胞(或：使农杆菌处于易于吸收外源DNA的状态) 潮霉素(3)含放射性同位素标记的CSP基因 除植株3外，其他4株转基因玉米CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中 (4) 低温耐受性
2.(2021·扬州模拟)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取______合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用______技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____(填写字母，单选)。A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是 。(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是 _。(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与 的生物学功能一致。
【解析】(1)为获取HSA基因，可通过反转录法，首先需采集人的血液，提取合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。由于DNA两条链是反向平行的，复制时也是方向相反，题图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，则另一条引物位于另一条链的相反一端。如图所示：
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，故若构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是水稻胚乳细胞启动子。(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。(4)由于大肠杆菌为原核生物，无生物膜系统，而水稻为真核生物，具有生物膜系统，故与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工。(5)为证明rHSA具有医用价值，需对基因工程的产物进行鉴定，即确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
答案：(1)总RNA(或mRNA) PCR(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 (5)HSA
【易错警示】基因工程应用中的几个易错点(1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的；(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体；(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因；(4)Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后才产生毒性。
考向二 结合蛋白质工程的流程，考查生命观念的结构与功能观和科学思维的比较和分类4.(2021·佛山模拟)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是 ( )A.该工程可以定向改变蛋白质分子的结构B.改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的C.改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种D.改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
【解析】选D。蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要，A正确；蛋白质工程的实质是通过改变基因的结构来改变蛋白质的功能，B正确；改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种，C正确；蛋白质工程改变的是基因，是可以遗传的，所以改造后的中华鲟的后代可能具有改造的蛋白质，D错误。
5.(2021·盐城模拟)免疫预防以人工主动免疫为主要目的，其主要措施是接种疫苗。第一代疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和类毒素，第二代疫苗包括由微生物的天然成分及其产物制成的重组蛋白疫苗，第三代疫苗的代表是基因疫苗。基因疫苗是将编码外源性抗原的基因插入质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。下列说法错误的是 ( )
A.疫苗经注射进入人体后，可被人体的B、T细胞特异性识别B.注射疫苗后，人体产生特异性免疫反应，并产生相应记忆细胞C.基因疫苗能表达蛋白质等抗原结构，从而引起机体产生免疫反应D.利用蛋白质工程生产的蛋白质疫苗就是基因疫苗
【解析】选D。人体中的B、T细胞都能特异性识别抗原，分别增殖、分化成浆细胞、记忆细胞和效应T细胞、记忆细胞，A正确；注射疫苗后，人体产生特异性免疫反应，并产生相应记忆细胞，保持对抗原的记忆，B正确；基因的表达产物是蛋白质，其他生物的蛋白质可成为人体的抗原，C正确；基因疫苗的本质是DNA或RNA，不是蛋白质，D错误。
6.(2020·湖北名师联盟模拟)正常细胞不能合成干扰素，但含有干扰素基因。我国科学家釆用基因工程技术生产干扰素a-2b已实现量产。具体做法是将产生干扰素的人白细胞的mRNA分离，反转录得到干扰素基因。将含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，用连接酶连接。将重组载体DNA分子在一定条件下导入大肠杆菌，在培养基中筛选培养，检测干扰素的表达量，选出高效表达的工程菌。请回答：
(1)在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是_____________。 (2)据图分析，构建重组载体DNA分子时，可以选用______两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，目的是既能保证目的基因和质粒正向连接，又能防止 (答两点)。(3)将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含______的选择培养基上培养，就可得到含质粒pBR322或重组质粒的细菌单菌落；再从每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有________的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌，原因是 。
(4)干扰素在体外保存非常困难，如果将其分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在-70 °C条件下可以保存半年。实现这一转变需要直接对___________进行修饰或改造，这属于蛋白质工程的范畴。
【解析】(1)细胞分化的实质是基因选择性表达，故在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是基因的选择性表达。(2)标记基因可用于鉴定目的基因是否导入受体细胞，所以重组质粒上至少要保留一个标记基因，由于两个标记基因上均含有酶A的切点，所以不能用酶A切割，为了防止连接时目的基因和质粒自身环化，故在构建重组载体DNA分子时，可以选用酶B和酶C两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切。
(3)由于质粒和重组质粒上都含有氨苄青霉素抗性基因，而未导入质粒的细菌不含有该抗性基因，所以将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含氨苄青霉素的选择培养基上培养，就可得到含质粒pBR322或重组质粒的细菌单菌落；由于目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此再从前面培养基上获得的每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌。(4)蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造的一项技术。
答案：(1)基因的选择性表达 (2)酶B、酶C 质粒与目的基因自身环化；防止同时破坏质粒中的两个标记基因(3)氨苄青霉素 四环素 目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在含有四环素的培养基上，导入重组质粒的细菌不能生长，而只导入质粒的细菌能生长 (4)基因
【知识总结】蛋白质工程与基因工程的比较(1)区别：
(2)联系。①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
【加固训练·拔高】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： 。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【解题指南】题干关键信息：遗传信息在不同分子之间的流动。
【解析】本题考查蛋白质工程和中心法则的相关内容。(1)蛋白质P1是由蛋白质P改变了两个氨基酸序列得到的，故若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列进行改造。(2)P1基因可以在P基因的基础上经修饰改造而成，也可以根据氨基酸序列用化学方法合成。中心法则的内容为： ，包括DNA的复制，RNA的复制，遗传信息由DNA→RNA、由RNA→DNA、由RNA→蛋白质五个过程。
(3)蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。该基因表达后得到相应蛋白质，蛋白质是否符合我们的设计要求，还需要进一步对蛋白质的生物功能进行检测与鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
【拓展视野】肿瘤细胞的靶向治疗 随着社会和科技的发展，癌症治疗观念正在发生根本性的改变，即由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变。应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的“靶向治疗”和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的“靶点治疗”是肿瘤研究的热点。
根据靶向部位的不同，又可以将肿瘤靶向治疗分为二大类，即肿瘤细胞靶向治疗和肿瘤血管靶向治疗。肿瘤细胞靶向治疗是利用肿瘤细胞表面的特异性抗原或受体作为靶向，而肿瘤血管靶向治疗则是利用肿瘤区域新生毛细血管内皮细胞表面的特异性抗原或受体起作用。虽然那些针对肿瘤细胞的单克隆抗体的靶向特性在某种程度上提高了局部肿瘤组织内的浓度，但由于这些大分子物质要到达肿瘤细胞靶区，仍然需要通过血管内皮细胞屏障，这一过程是相对缓慢的。而血管靶向药物则有很大的优势，在给药后可以迅速高浓度地积聚在靶标部位。
第4课 基 因 工 程
核心概念·自查
【概念导图】 一图知全局
【概念梳理】 闭书测基础一、基因工程1.概念：
目的基因
体外
分子水平
定向
2.基本工具：(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)。①本质：蛋白质。②来源：主要是从_____生物中分离纯化出来的。③作用：识别特定的___________并切开特定部位的两个核苷酸之间的____________。
原核
核苷酸序列
磷酸
二酯键
④结果：产生_________或平末端，图示：
黏性末端
(2)DNA连接酶：
(3)载体。①种类：_____、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②特点和意义：
质粒
一个至多个
标记
③作用。a.作为运载工具，将_________转移到受体细胞内。b.利用它在_________内对目的基因进行大量复制。
目的基因
受体细胞
3.基本操作程序：(1)目的基因的获取：①目的基因：主要是指___________的基因，也可以是一些具有_____作用的因子。②获取目的基因的方法。b.利用PCR技术扩增目的基因。
编码蛋白质
调控
c.用化学方法人工合成：
核苷酸序列
DNA合成仪
反转录酶
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心：①基因表达载体的组成及作用：
②构建过程：
(3)将目的基因导入受体细胞“三种类型”比较：
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
Ti质粒的T-DNA上
染色体的DNA上
显微注射
新性状
感受态
感受态细胞
(4)目的基因的检测与鉴定的“两个水平”：
二、蛋白质工程1.流程图。A._____，B._____，C._________，D._______，E._________。2.手段：_________或_________。3.结果：改造了现有蛋白质或制造出___________。4.应用：主要集中应用于对___________进行改造，改良生物性状。
转录
翻译
分子设计
多肽链
预期功能
基因修饰
基因合成
新的蛋白质
现有蛋白质
【概念辨析】 全面清障碍1.判断下列有关基因工程工具叙述的正误：(1)限制酶只能用于切割目的基因。 ( )分析：限制酶既能用于切割目的基因，也能用于切割载体，并且一般用同一种限制酶切割目的基因和载体。(2)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。( )分析：质粒是基因工程中常用的工具而不是工具酶。
×
×
(3)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 ( )分析：E·coliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端。(4)限制酶也可以识别和切割RNA。 ( )分析：限制酶又称限制性核酸内切酶，专一对DNA起作用。
×
×
2.判断下列基因工程的基本操作程序叙述的正误：(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因。 ( )分析：目的基因大多是编码蛋白质的基因，少数是具有调控作用的因子，如启动子、终止子等。(2)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )(3)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达。 ( )分析：应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在以及是否转录，但不能确定目的基因是否指导合成了抗冻蛋白。
×
√
×
3.判断下列有关基因工程的应用及蛋白质工程叙述的正误：(1)转基因抗虫植物一定能抗病。 ( )分析：植物病症由细菌、病毒等引起，抗虫植物不一定抗病。(2)转基因抗病农作物不需要使用农药。 ( )分析：转基因抗病农作物只能抵抗某种病原体，可以减少农药的使用量。(3)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 ( )分析：蛋白质分子不能复制，蛋白质工程应对基因进行操作。(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 ( )
×
×
×
√
【概念活用】 教材命题源教材选修3 P5 图1-3：
分析图可知，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是_______，切割位点在G和A之间，切开G和A之间的___________；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是_______，切割位点在_____之间，切开的是G和C之间的磷酸二酯键。
GAATTC
磷酸二酯键
CCCGGG
C和G
教材选修3 P10“生物技术资料卡”：cDNA文库如何建成？为什么不含有启动子和内含子？提示：cDNA文库是以某一发育时期细胞中的mRNA为模板反转录形成的。mRNA中不含有启动子和内含子对应的碱基序列，故cDNA文库不含启动子和内含子。
关键能力·进阶
考点一 基因工程的工具 【典例精研引领】(2020·北京高考)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。(1)纤维素属于______糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是____________。
(2)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。(3)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是____________。
(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用 。(举一例)
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。(2)由于密码子具有简并性，所以即使克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。(3)根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamHⅠ进行切割，而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。(4)本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，对照组2的处理是直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶(C1酶)。(5)该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
答案：(1)多 葡萄糖 (2)密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸(3)BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)(4)向培养基中接种纤维素酶(C1酶) (5)降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【母题变式延伸】核心素养新命题(1)为使获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，除用同一种限制酶切割外，能否用其他酶切割？为什么？(科学思维：类比与推理，归纳与演绎)提示：可以。为使载体和目的基因相连，只要切出相同的黏性末端即可，可以是同一种酶，也可以是不同种酶。(2)克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部为什么不能有这两种酶切位点？提示：若该基因内部有这两种酶切位点，目的基因将会被切割，基因表达载体将会缺少完整的目的基因。
【知能素养提升】1.DNA连接酶和限制酶的关系：(科学思维：分析与综合)(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)DNA连接酶起作用时，区别于DNA聚合酶不需要模板。
2.与DNA相关的五种酶的比较：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 结合工具酶的使用，考查生命观念的结构与功能观1.(2021·南昌模拟)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段(限制酶在对应切点一定能切开)，酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是 ( )
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图1中酶催化反应的化学键是磷酸二酯键C.图2中②可能是用XhoⅠ处理得到的酶切产物D.用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到7种产物
【解析】选D。酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；图1中酶用来切割DNA，DNA单链是脱氧核苷酸通过磷酸二酯键相连，因此酶催化反应的化学键是磷酸二酯键， B正确；分析图1，限制酶XhoⅠ有2处切割位点，切割后产生3个DNA片段，泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物，C正确；从图1可知，用XhoⅠ和SalⅠ同时处理该DNA电泳后得到6种产物，D错误。
2.在基因工程中，作为基因运输工具的载体，下列哪项不是载体必须具备的条件 ( )A.能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存B.具有一个至多个限制酶切割位点C.必须是细菌的质粒D.具有某些标记基因
【解析】选C。载体能在宿主细胞中复制并稳定保存，A正确；载体具有多个限制酶切割位点，以便于外源基因连接，B正确；最常用的载体是质粒，也可以是噬菌体、动植物病毒，C错误；载体除具有限制酶切割位点外必须含有标记基因，便于筛选，D正确。
【方法技巧】限制酶的选择方法根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
考向二 通过载体的应用，考查生命观念的结构与功能观3.(2021·临沂模拟)基因工程中使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组质粒的构建和筛选。已知限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，据图分析错误的是 ( )
A.限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同B.用限制性核酸内切酶Ⅱ切割获得目的基因时，会有20个氢键发生断裂C.质粒只能用限制性核酸内切酶Ⅰ切割，目的基因可以只用限制性核酸内切酶Ⅱ切割D.选用限制酶切割目的基因时，只要目的基因两端的序列中含有该酶的识别序列即可
【解析】选D。据题可知，限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ虽然识别的序列不同，但切割后获得的黏性末端相同，A正确；GATC对应的DNA序列含有10个氢键，用限制性核酸内切酶Ⅱ切割获得目的基因时，目的基因两端均会形成GATC单链，会有20个氢键发生断裂，B正确；若用限制酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都会被破坏，用限制酶Ⅰ切割目的基因不能获得目的基因，因此质粒用限制性核酸内切酶Ⅰ切割，目的基因用限制性核酸内切酶Ⅱ切割，C正确；选用限制酶切割目的基因时，除了目的基因两端的序列中含有该酶的识别序列，还要考虑与载体结合的问题，D错误。
4.(2021·河北模拟)基因和表达载体相连时既可以正向连接也可以反向连接。如图甲、乙分别表示某质粒、含目的基因和酶切位点的DNA片段，构建基因表达载体时应用酶B和酶C进行切割，不应用酶A切割运载体和DNA片段，其原因不包括 ( )
A.防止目的基因和载体发生反向连接B.保证构建的重组质粒中含有标记基因C.防止目的基因或载体重新自身环化D.保证构建的重组质粒中含有启动子
【解析】选D。质粒和含目的基因的DNA片段上都有酶B和酶C的酶切位点，酶B和酶C切割后产生的黏性末端不同，可以防止目的基因和载体发生反向连接，A正确；用酶B和酶C进行切割后，重组质粒中还含有氨苄青霉素抗性基因可作为标记基因，若用酶A切割，质粒中的两个标记基因都会被破坏，B正确；酶B和酶C切割后产生的黏性末端不同，可防止目的基因或载体重新自身环化，C正确；无论用哪种酶切都不会破坏质粒中的启动子，重组质粒中都含有启动子，D错误。
5.(2021年湖北适应性测试)某实验室需构建含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的表达载体用于科学研究。相关资料如下：(1)双链DNA的每一条链有两个末端，分别是5’端和3’端，从左到右的5’-3’DNA链是编码链，从左到右的3’-5’ DNA链是模板链。(2)增强型绿色荧光蛋白(eGFP)在自然光下显示绿色，已知该基因的DNA编码序列如下：5’ATGGTGAGC……AAGTAA 3’。
(3)质粒载体中含有EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、XbaⅠ、和NotⅠ等酶的酶切位点(这些酶各自的识别序列不同)，如下图所示。
回答下列问题：(1)增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为___________。 (2)通过PCR方法获得eGFP目的片段，首先需要设计______(填“一对”或“一个”)引物，在体外选择性扩增eGFP目的片段，PCR反应一般由95 ℃热变性、55～60 ℃引物和模板配对、72 ℃延伸三个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72 ℃是综合考虑了两个因素，这两个因素是______和______。
(3) eGFP的PCR产物两端分别含有BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点，构建重组表达载体时，用这两种酶酶切PCR产物和质粒载体。与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是____________(答一点即可)。 (4)将所构建的表达载体转入大肠杆菌，涂布含有卡那霉素的平板，若表达载体构建成功，可观察到多个___________单菌落。
【解析】本题主要考查基因工程、PCR技术、微生物培养等知识的运用能力。(1)已知DNA编码序列为5’ATGGTGAGC……AAGTAA 3’，则其模板链应为3’TACCACTCG……TTCATT 5’，基因转录时，以DNA的模板链为模板，依据碱基互补原则合成一条mRNA链，故增强型绿色荧光蛋白基因转录的mRNA碱基序列为5’AUGGUGAGC……AAGUAA 3’。(2)DNA有两条链，故利用PCR扩增目的基因时，应依据与目的基因碱基序列互补，设计一对引物；72 ℃延伸温度应考虑酶的活性以及利于模板与引物结合两个因素。(3)与单一酶酶切相比，该实验采用的双酶切方法的优点是目的基因和载体均可产生两个不同末端，可有
效防止目的基因自身环化(或防止目的基因与载体错误连接)。(4)卡那霉素抗性基因为标记基因，用于重组DNA的筛选与鉴定，若表达载体构建成功，表达载体含eGFP(绿色荧光蛋白)基因，故在含卡那霉素的培养基中存活下来并形成的菌落应该在自然光照下显示绿色。
答案： (1)5’AUGGUGAGC……AAGUAA 3 ’(2)一对 酶的活性 模板与引物结合(3)防止目的基因自身环化(或防止目的基因与载体错误连接)(4)绿色荧光
【知识总结】载体上标记基因及其作用原理(1)载体上的标记基因：一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。(2)作用原理：当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
【加固训练·拔高】1.(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是 。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有___________，不能表达的原因是 。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_______________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【解析】本题主要考查限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用及基因表达载体的构建。(1)BamHⅠ和Sau3AⅠ的共同识别序列是—GATC—，二者切割形成的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的前端，终止子应位于目的基因的后端，这样目的基因才能顺利地转录并完成翻译过程，即顺利表达，图中所示甲、丙均不符。(3)常见的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和E·coli DNA连接酶，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。
答案：(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案亦可)(3)E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶
2.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________；并且________和_________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自________。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为：具有一个或多个限制酶切点；具有自我复制能力；带有标记基因；对宿主细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(3)噬菌体营寄生生活，能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素 (3)受体细胞
考点二 基因工程的基本操作程序【典例精研引领】(2021·宝鸡模拟)某种小麦具有极强的耐盐性，其耐盐性与小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因(耐盐基因)有关。科学家将该基因转移到水稻细胞中，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：(1)理论上基因组文库含有生物的______基因；而cDNA文库含有生物的______基因。 (2)若要从该种小麦中获得Na+/K+逆向转运蛋白基因，可首先建立该种植物的基因组文库，再从中____________出所需基因。
(3)将Na+/K+逆向转运蛋白基因导入水稻细胞中的常用方法是___________。 (4)为保证Na+/K+逆向转运蛋白基因(耐盐基因)在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的____________(填“复制原点”“启动子”或“标记基因”)。 (5)筛选出含有目的基因的水稻细胞，经过________过程，培养出愈伤组织，再诱导愈伤组织形成水稻幼苗。将转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中进行耐盐试验，用非转基因幼苗作对照，培养一个月后观察现象，若_________，则说明转基因植株获得了耐盐特性。
(6)假如用得到的二倍体转基因耐盐植株自交，子代中耐盐与不耐盐植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐盐基因整合到了_______________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)基因组文库含有某种生物的全部基因；cDNA文库中只含有该种生物的部分基因。(2)若要从该种小麦中获得Na+/K+逆向转运蛋白基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中筛选出所需的耐盐基因。(3)水稻是单子叶植物，基因表达载体导入水稻细胞常用基因枪法。(4)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。因此为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的启动子。
(5)愈伤组织是水稻细胞经过脱分化过程形成的。将转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养一个月后观察现象，若转基因植株获得了耐盐特性，则说明转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄)。(6)假如用得到的二倍体转基因耐盐植株自交，子代中耐盐与不耐盐植株的数量比为3∶1时，该比例符合杂合子自交后代的结果，则可推测该耐盐基因整合到了同源染色体的一条上。
答案：(1)全部 部分 (2)筛选 (3)基因枪法(4)启动子 (5)脱分化 转基因植株存活率高于非转基因植株(转基因植株叶片不变黄，非转基因植株叶片变黄)(6)同源染色体的一条上
【母题变式延伸】核心素养新命题(1)Na+/K+逆向转运蛋白转运Na+/K+时，该物质以哪种方式进出细胞，为什么？(科学思维：分析与综合)提示：方式是主动运输， Na+/K+转运是逆浓度梯度。(2)科学家在将目的基因导入双子叶植物细胞时，常用的转化方法是什么？原理是什么？(生命观念：结构与功能观)提示：农杆菌转化法，植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上，则目的基因将被一起带入)。
【备选典例】 (2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5'末端，获得了L1-GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是___________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______，也是为了保证_____________。 (2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了______和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的____________移入牛的_______________中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的___________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
【解析】(1)将甲插入质粒P0时，为了保证甲(L1-GFP融合基因)的完整性，应该选择E1和E4两种酶切割，并且把目的基因插入启动子和终止子之间，从而使其能在受体细胞中表达。(2)在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光表明基因已表达，而基因的表达包括转录和翻译两个过程。(3)由(4)题意可知，获得含有L1-GFP融合基因(甲)的牛为克隆牛，需要用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入去核卵母细胞中。(4)检测甲是否存在于牛的不同组织细胞中，可以采用PCR技术扩增，再用DNA分子杂交技术来检测，PCR技术中模板是DNA，并不是RNA。
答案：(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译(3)细胞核 去核卵母细胞 (4)核DNA
【知能素养提升】1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类：(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因。(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点。(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间。
cDNA文库与基因组文库的比较：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 结合目的基因的获取，考查比较与分类能力1.(2021·济宁模拟)利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如图所示。下列说法错误的是 ( )
A.cDNA文库的构建需要用到反转录酶B.cDNA文库的基因数目比基因组文库的基因数目少C.核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D.从该文库中可筛选到胰高血糖素基因
【解析】选D。cDNA是以mRNA为模板，经反转录酶催化形成的，故cDNA文库的构建需要用到反转录酶，A正确；由于cDNA文库中只含有一种生物的一部分基因，而基因组文库中含有一种生物的全部基因，故两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，B正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对，C正确；胰岛B细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛B细胞内提取不到胰高血糖素基因的mRNA，无法逆转录形成胰高血糖素基因的cDNA，故不能从利用人胰岛B细胞构建的cDNA文库中筛选到胰高血糖素基因，D错误。
2.(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括___________和________。 (2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是___________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。(1)基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。(2)体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键，DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90～95 ℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。 (3)由于在PCR过程中，需要不断地改变温度，该过程中涉及较高温度处理，大肠杆菌DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq酶催化。
答案：(1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
考向二 通过基因工程操作的基本程序，考查制订实施方案的能力3.(2021·北理工附中模拟)为增加玉米抗旱性，科研人员构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是 ( )A.提取该微生物mRNA反转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因B.将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌C.用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作D.用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状
【解析】选D。提取该微生物mRNA，在反转录酶的催化作用下，反转录为cDNA，再通过PCR可获得大量目的基因，A正确；农杆菌经钙离子处理后，成为感受态，使其易于吸收周围的DNA分子，所以将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌，B正确；用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作，防止杂菌污染，C正确；用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D错误。
4.(2021·汉中模拟)HIV(艾滋病病毒)为逆转录病毒，而逆转录酶缺乏校正修复功能，导致HIV的变异频率非常高。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重要手段之一。请根据相关知识回答下列问题：
(1)科学工作者利用转基因技术研制HIV疫苗取得了一定进展，如图是该技术的操作简要路径(①②③表示操作步骤)：图中②表示____________，目的基因的载体有___________(答出三种)，要检测目的基因是否插入酵母菌的DNA，可采用____________技术，利用探针检测酵母菌的基因，如果出现________，就表明目的基因已插入酵母菌DNA中。 (2)在基因工程中将重组质粒导入不同的受体细胞可采用不同的方法，若是导入植物细胞，采用最多的方法是___________，若是导入大肠杆菌，一般情况下，需要制备感受态细胞，原因是___________________________。
【解析】(1)基因工程的操作步骤：获取目的基因、基因表达载体的构建、把目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。图中②表示构建基因表达载体。在基因工程中使用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。要检测目的基因是否插入受体细胞内的DNA上，检测方法是采用DNA分子杂交技术，利用含有放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测受体细胞的基因，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入受体细胞DNA中。
(2)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，将质粒上的T-DNA转移到受体细胞。大肠杆菌属于微生物，由于未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱，作为受体细胞需要经过钙离子处理使其处于感受态，感受态细胞容易吸收周围环境中的DNA。
答案：(1)基因表达载体的构建 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等 DNA分子杂交 杂交带(2)农杆菌转化法 未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
【加固训练·拔高】1.(2020·江苏高考)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种___________酶，它通过识别特定的___________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化____________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是____________(从引物①②③④中选择，填编号)。
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____________。A.5'- AACTATGCG-------AGCCCTT-3'B.5'- AATTCCATG-------CTGAATT-3' C.5'- GCAATGCGT------TCGGGAA-3'D.5'- TTGATACGC------CGAGTAC-3'
【解析】本题主要考查PCR的过程和应用。(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
(3)引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 核苷酸序列(2)磷酸二酯键 DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④ (4)B
2.(2021·赤峰模拟)斑马鱼的HuC基因在早期胚胎神经细胞中选择性表达，研究人员构建了HuC基因的表达载体，并导入斑马鱼细胞中研究其作用，请回答：
(1)为获取HuC基因，研究人员从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过___________________ 获得大量的DNA，进而构建出HuC基因的________。(2)DraⅢ，SnBⅠ等是质粒上不同限制酶的切割位点。为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的____________酶进行切割，这样做的原因是________________________。不选择NotⅠ酶切割的原因是________________________。 (3)用Ca2+处理大肠杆菌，大肠杆菌细胞即能够_________________。实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察___________或者在培养基中添加________，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
【解析】(1)从早期胚胎神经细胞中提取HuC基因的mRNA，通过逆转录过程合成目的基因，并通过PCR技术在体外扩增可获得大量的目的基因，进而构建出HuC基因的cDNA文库。
(2)构建基因表达载体时，不能破坏运载体上的启动子、复制原点，以及运载体上需要保留的标记基因，为了防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接，常用不同的限制酶切割质粒和目的基因，结合图示中各种限制酶的酶切位点可知，为获得HuC基因——绿色荧光蛋白基因的表达载体，需要对HuC基因和质粒选用图中的EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行切割。卡那霉素抗性基因为标记基因，若用NotⅠ酶切割，将会导致卡那霉素抗性基因被破坏，且切割后的质粒会失去启动子，使基因表达载体中缺少标记基因无法筛选，且没有启动子无法转录，所以不选择NotⅠ酶切割质粒。
(3)用Ca2+处理大肠杆菌使之成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的DNA分子。由于绿色荧光蛋白表达后会发绿光，所以实验过程中可以采用在荧光显微镜下观察表达的绿色荧光蛋白菌落或者在培养基中添加卡那霉素，筛选出导入表达载体的大肠杆菌。
答案：(1)逆转录和PCR技术扩增 cDNA文库(2)EcoRⅠ酶和BamHⅠ 可以防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与质粒反向连接破坏标记基因无法筛选(且没有启动子) (3)吸收周围环境中的DNA分子 表达的绿色荧光蛋白菌落 卡那霉素
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程的崛起【典例精研引领】(2021·郑州模拟)X-连锁重症联合免疫缺陷是一种单基因遗传病，患者缺乏特异性免疫机能。研究人员尝试对20名患病儿童进行基因治疗。他们提取并培养患者的造血干细胞，然后利用逆转录病毒载体将正常基因插入细胞的染色体中，最后将改造后的造血干细胞移植给患者。这些患者的免疫缺陷被治愈了，但有5名儿童患了白血病。回答下列问题：
(1)逆转录病毒载体是对天然逆转录病毒改造获得的，改造时要破坏逆转录病毒的外壳蛋白基因等对细胞有害的基因，增加_____酶作用位点和____基因。(2)利用__________技术可以检测正常基因是否已成功插入细胞的染色体中。(3)研究人员在培养造血干细胞过程中，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中，CO2的主要作用是____________。培养过程中应定期更换培养液，目的是________________________________。 (4)与用捐赠者的造血干细胞进行移植相比，基因治疗的优点是__________。但基因治疗也有一定的风险，例如上文中患儿白血病的致病原因是_______。
【名师授法解题】抓题眼练思维
【解析】(1)作为运载体需要具备自我复制能力；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因等条件。依据题文可知，改造逆转录病毒基因时，需要增加限制酶作用位点和标记基因。(2)根据目的基因的检测和鉴定可知，检测正常基因是否已成功插入细胞的染色体中，应该用DNA分子杂交技术。(3)培养造血干细胞过程中，需将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中，CO2的主要作用是维持培养液的pH，从而为细胞内酶的活性提供适宜的pH条件。培养过程中应定期更换培养液，目的是清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(4)基因治疗的优点是不会发生免疫排斥反应。癌变是原癌基因或抑癌基因突变的结果，题文中患儿白血病的致病原因是外源基因插入原癌基因(或抑癌基因)中导致基因突变从而发生细胞癌变。
答案：(1)限制 标记 (2) DNA分子杂交(3)维持培养液的pH 清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害(4)不会发生免疫排斥 外源基因插入原癌基因(或抑癌基因)中导致细胞癌变
【母题变式延伸】 核心素养新命题(1)最常用的核酸探针是哪种？怎样制作？(生命观念：结构与功能观)提示：DNA探针；DNA探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，可用同位素进行标记。(2)为什么虽然基因治疗技术向人类展示了它奇妙的“魔术师”般的魅力，但也有大量的科学家对这种技术的发展表示出极大的担忧？(社会责任：关爱生命)提示：①安全问题；②体内表达基因的可控性问题；③外源基因不能在体内长期稳定表达；④目的基因转移效率不高；⑤基因治疗的复杂性问题；⑥基因治疗中靶细胞生物学特性改变的问题；⑦伦理方面的问题。
【知能素养提升】1.概念辨析：(生命观念：结构与功能观)(1)基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。(2)基因探针：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。(3)基因芯片：将数以万计、乃至百万计的基因探针有规律地排列在支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。(4)基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
2.比较基因治疗与基因诊断：(科学思维：比较与分类)
【热点考向演练】考向一 利用基因工程在生产、生活中的应用，考查生命观念的结构与功能观和关爱生命的社会责任1.(2021·烟台模拟)帝王蝶的幼虫吃一种叫作“乳草”的有毒植物(乳草产生的毒素“强心甾”有能够结合并破坏动物细胞钠钾泵的功能)，而且还能将“强心甾”储存在体内以防御捕食者。研究人员发现帝王蝶的钠钾泵的119和122位氨基酸与其他昆虫不同。利用基因编辑技术修改果蝇钠钾泵基因，发现122位氨基酸改变使果蝇获得抗“强心甾”能力的同时导致果蝇“瘫痪”，119位氨基酸改变无表型效应，但能消除因122位氨基酸改变导致的“瘫痪”。根据以上信息可做出的判断是 ( )
A.帝王蝶在进化历程中119、122位氨基酸的改变一定是同时发生的B.帝王蝶钠钾泵突变基因是由于“强心甾”与钠钾泵结合后诱发突变形成的C.通过基因编辑技术研究果蝇钠钾泵基因功能时设置了三个实验组D.“强心甾”与钠钾泵结合的普通动物细胞，一般会因渗透压失衡而破裂
【解析】选C。利用果蝇为实验材料证明了第122位氨基酸改变使果蝇获得抗“强心甾”能力，但不能证明帝王蝶在进化历程中119、122位氨基酸的改变一定是同时发生的，A错误；“强心甾”与钠钾泵结合后，破坏了钠钾泵的结构，进而破坏了钠钾泵的功能，但不能推测出“强心甾”与钠钾泵结合后诱发基因突变的结论，B错误；由分析可知，通过基因编辑技术研究果蝇钠钾泵基因功能时设置了三个实验组，C正确；“强心甾”与钠钾泵结合会导致钠钾泵的功能被破坏，据此可推测“强心甾”能导致普通动物细胞兴奋传导异常，D错误。
2.(2021·日照模拟)基因编辑是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部片段，定点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传性改变的技术。如图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中用SgRNA指引核酸内切酶Cas9结合到特定的靶位点。下列分析不合理的是 ( )
A.图中B基因缺失一段核苷酸序列可能导致基因突变B.图中SgRNA1的碱基序列和SgRNA2碱基序列相同或互补C.Cas9可识别特定的核苷酸序列使核苷酸间的磷酸二酯键断裂D.根据上述处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能
【解析】选B。图中B基因缺失一段核苷酸序列可能导致基因突变，A正确；图中SgRNA1的碱基序列和SgRNA2碱基序列结合的是不同的DNA区段，故一般情况下二者既不相同也不互补，B错误；核酸内切酶Cas9可识别特定的核苷酸序列，并从特定的位点切割磷酸二酯键，C正确；通过破坏B基因前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能，D正确。
3.(2021·邯郸模拟)我国科学家目前正在探索培育过量表达蔗糖转运蛋白基因(TaSUT1A)的转基因小麦，通过分析TaSUT1A在转基因小麦中的遗传及其在抗干旱环境中的作用，选育抗旱的转基因小麦新品种。小麦属于单子叶植物，如图为基本技术流程示意图。请回答下列问题：
(1)为了大量扩增分离得到的TaSUT1A，一般采用的技术是___________，该技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是____________。(2)一般采用相同的_________切割目的基因片段与载体，原因是_________。(3)将构建好的基因表达载体导入小麦细胞常用________法，但成本较高；受体细胞经脱分化形成愈伤组织，脱分化是让已经分化的细胞经诱导后失去其___________________的过程。 (4)为了证明TaSUT1A是否表达，可以通过_____检测有无蔗糖转运蛋白生成，并通过与______中蔗糖转运蛋白含量的对比来确定TaSUT1A是否过量表达。
【解析】(1)为了大量扩增分离得到的TaSUT1A，一般采用的是PCR技术，该技术扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是根据这一序列合成引物。(2)一般采用相同的限制酶切割目的基因片段与载体，这样可获得相同的黏性末端，便于DNA连接酶连接。(3)将构建好的基因表达载体导入小麦细胞常用基因枪法。愈伤组织在结构形态上的特点是呈无固定形态的薄壁细胞。脱分化是让已经分化的细胞经诱导后失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。
(4)为了证明TaSUT1A是否表达，可以通过抗原-抗体杂交检测有无蔗糖转运蛋白生成，并通过与普通正常小麦中蔗糖转运蛋白含量的对比来确定TaSUT1A是否过量表达。
答案：(1)PCR技术 根据这一序列合成引物(2)限制性核酸内切酶(或限制酶) 获得相同的黏性末端(3)基因枪 特有的结构和功能而转变成未分化细胞(4)抗原-抗体杂交 普通正常小麦
【加固训练·拔高】1.(2021·滨州模拟)玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP(冷激蛋白)基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。
(1)研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知_______________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需____次扩增才能获得所需的ubi启动子。(2)图1所示的流程图中，过程①需_______________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插入部位为______。过程②需要用CaCl2溶液处理农杆菌，其目的是____________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含______的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。
(3)研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为 ________片段，实验结果表明__________________。(4)在个体水平上对转基因玉米植株进行________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。
【解析】(1)在利用PCR技术进行扩增时，需要事先设计引物，这里需要根据ubi启动子设计合适的引物，因此需已知ubi两端的一段序列，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需3次扩增才能获得引物之间的核苷酸序列，即至少需3次扩增才能获得所需的ubi启动子。
(2)图1中，过程①为载体和目的基因相连的过程，因此需限制酶和DNA连接酶的催化从而实现连接，在获得ubi-CSP基因构建表达载体时，需要将ubi-CSP基因插入T-DNA内部(且不破坏hpt)，这样能保证T-DNA转移时携带目的基因与玉米的染色体DNA连接。过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，因为处于感受态的农杆菌易于吸收外源DNA，过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含潮霉素的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经脱分化过程长成幼苗，从而获得了转基因玉米植株。
(3)图2所示为放射性检测结果，因此这里的基因探针为含放射性同位素标记的CSP基因片段，实验结果显示在第1、2、4、5株玉米中检测出目的基因的放射性，据此可知除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。(4)在个体水平上，可以通过对转基因玉米植株进行低温耐受性实验，进而检测CSP基因是否在玉米中成功表达。
答案：(1)ubi两端的一段序列 3(2)限制酶和DNA连接酶 T-DNA内部(且不破坏hpt) 获得感受态细胞(或：使农杆菌处于易于吸收外源DNA的状态) 潮霉素(3)含放射性同位素标记的CSP基因 除植株3外，其他4株转基因玉米CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中 (4) 低温耐受性
2.(2021·扬州模拟)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取______合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用______技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____(填写字母，单选)。A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是 。(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是 _。(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与 的生物学功能一致。
【解析】(1)为获取HSA基因，可通过反转录法，首先需采集人的血液，提取合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。由于DNA两条链是反向平行的，复制时也是方向相反，题图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，则另一条引物位于另一条链的相反一端。如图所示：
(2)启动子通常具有物种及组织特异性，故若构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是水稻胚乳细胞启动子。(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。(4)由于大肠杆菌为原核生物，无生物膜系统，而水稻为真核生物，具有生物膜系统，故与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工。(5)为证明rHSA具有医用价值，需对基因工程的产物进行鉴定，即确认rHSA与HSA的生物学功能一致。
答案：(1)总RNA(或mRNA) PCR(2)B (3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 (5)HSA
【易错警示】基因工程应用中的几个易错点(1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的；(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体；(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因；(4)Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后才产生毒性。
考向二 结合蛋白质工程的流程，考查生命观念的结构与功能观和科学思维的比较和分类4.(2021·佛山模拟)中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是 ( )A.该工程可以定向改变蛋白质分子的结构B.改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的C.改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种D.改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质
【解析】选D。蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要，A正确；蛋白质工程的实质是通过改变基因的结构来改变蛋白质的功能，B正确；改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种，C正确；蛋白质工程改变的是基因，是可以遗传的，所以改造后的中华鲟的后代可能具有改造的蛋白质，D错误。
5.(2021·盐城模拟)免疫预防以人工主动免疫为主要目的，其主要措施是接种疫苗。第一代疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和类毒素，第二代疫苗包括由微生物的天然成分及其产物制成的重组蛋白疫苗，第三代疫苗的代表是基因疫苗。基因疫苗是将编码外源性抗原的基因插入质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。下列说法错误的是 ( )
A.疫苗经注射进入人体后，可被人体的B、T细胞特异性识别B.注射疫苗后，人体产生特异性免疫反应，并产生相应记忆细胞C.基因疫苗能表达蛋白质等抗原结构，从而引起机体产生免疫反应D.利用蛋白质工程生产的蛋白质疫苗就是基因疫苗
【解析】选D。人体中的B、T细胞都能特异性识别抗原，分别增殖、分化成浆细胞、记忆细胞和效应T细胞、记忆细胞，A正确；注射疫苗后，人体产生特异性免疫反应，并产生相应记忆细胞，保持对抗原的记忆，B正确；基因的表达产物是蛋白质，其他生物的蛋白质可成为人体的抗原，C正确；基因疫苗的本质是DNA或RNA，不是蛋白质，D错误。
6.(2020·湖北名师联盟模拟)正常细胞不能合成干扰素，但含有干扰素基因。我国科学家釆用基因工程技术生产干扰素a-2b已实现量产。具体做法是将产生干扰素的人白细胞的mRNA分离，反转录得到干扰素基因。将含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，用连接酶连接。将重组载体DNA分子在一定条件下导入大肠杆菌，在培养基中筛选培养，检测干扰素的表达量，选出高效表达的工程菌。请回答：
(1)在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是_____________。 (2)据图分析，构建重组载体DNA分子时，可以选用______两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，目的是既能保证目的基因和质粒正向连接，又能防止 (答两点)。(3)将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含______的选择培养基上培养，就可得到含质粒pBR322或重组质粒的细菌单菌落；再从每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有________的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌，原因是 。
(4)干扰素在体外保存非常困难，如果将其分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在-70 °C条件下可以保存半年。实现这一转变需要直接对___________进行修饰或改造，这属于蛋白质工程的范畴。
【解析】(1)细胞分化的实质是基因选择性表达，故在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是基因的选择性表达。(2)标记基因可用于鉴定目的基因是否导入受体细胞，所以重组质粒上至少要保留一个标记基因，由于两个标记基因上均含有酶A的切点，所以不能用酶A切割，为了防止连接时目的基因和质粒自身环化，故在构建重组载体DNA分子时，可以选用酶B和酶C两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切。
(3)由于质粒和重组质粒上都含有氨苄青霉素抗性基因，而未导入质粒的细菌不含有该抗性基因，所以将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含氨苄青霉素的选择培养基上培养，就可得到含质粒pBR322或重组质粒的细菌单菌落；由于目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此再从前面培养基上获得的每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌。(4)蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造的一项技术。
答案：(1)基因的选择性表达 (2)酶B、酶C 质粒与目的基因自身环化；防止同时破坏质粒中的两个标记基因(3)氨苄青霉素 四环素 目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在含有四环素的培养基上，导入重组质粒的细菌不能生长，而只导入质粒的细菌能生长 (4)基因
【知识总结】蛋白质工程与基因工程的比较(1)区别：
(2)联系。①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
【加固训练·拔高】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： 。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【解题指南】题干关键信息：遗传信息在不同分子之间的流动。
【解析】本题考查蛋白质工程和中心法则的相关内容。(1)蛋白质P1是由蛋白质P改变了两个氨基酸序列得到的，故若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列进行改造。(2)P1基因可以在P基因的基础上经修饰改造而成，也可以根据氨基酸序列用化学方法合成。中心法则的内容为： ，包括DNA的复制，RNA的复制，遗传信息由DNA→RNA、由RNA→DNA、由RNA→蛋白质五个过程。
(3)蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。该基因表达后得到相应蛋白质，蛋白质是否符合我们的设计要求，还需要进一步对蛋白质的生物功能进行检测与鉴定。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
【拓展视野】肿瘤细胞的靶向治疗 随着社会和科技的发展，癌症治疗观念正在发生根本性的改变，即由经验科学向循证医学、由细胞攻击模式向靶向性治疗模式转变。应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的“靶向治疗”和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的“靶点治疗”是肿瘤研究的热点。
根据靶向部位的不同，又可以将肿瘤靶向治疗分为二大类，即肿瘤细胞靶向治疗和肿瘤血管靶向治疗。肿瘤细胞靶向治疗是利用肿瘤细胞表面的特异性抗原或受体作为靶向，而肿瘤血管靶向治疗则是利用肿瘤区域新生毛细血管内皮细胞表面的特异性抗原或受体起作用。虽然那些针对肿瘤细胞的单克隆抗体的靶向特性在某种程度上提高了局部肿瘤组织内的浓度，但由于这些大分子物质要到达肿瘤细胞靶区，仍然需要通过血管内皮细胞屏障，这一过程是相对缓慢的。而血管靶向药物则有很大的优势，在给药后可以迅速高浓度地积聚在靶标部位。
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