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新高考生物一轮复习课件 第十单元 第2课 微生物的培养与应用（含解析）
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这是一份新高考生物一轮复习课件 第十单元 第2课 微生物的培养与应用（含解析），共60页。PPT课件主要包含了核心概念·自查，营养物质，生长繁殖，碳源氮源，特殊营养物质，杂菌污染，外来杂菌，各种成分，4灭菌，酒精灯火焰等内容，欢迎下载使用。
第2课 微生物的培养与应用
核心概念·自查
【概念导图】 一图知全局
【概念梳理】 闭书测基础一、微生物的实验室培养1.培养基：(1)概念：人们按照微生物对_________的不同需求，配制出供其_________的营养基质。(2)营养组成：一般都含有_______________和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对___、_____________以及氧气的要求。(3)种类①按照物理性质可分为_____培养基、固体培养基、半固体培养基。②按照成分的来源可分为天然培养基和_____培养基。③按照功能用途可分为选择培养基、_____培养基等。
营养物质
生长繁殖
水、碳源、氮源
pH
特殊营养物质
液体
合成
鉴别
2.无菌技术：(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止_________的方法。(2)关键：防止_________的入侵。(3)连线无菌技术的常用方法及适用对象
杂菌污染
外来杂菌
3.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：(1)计算：依据配方比例，计算配制100 mL的培养基时，_________的用量。(2)称量：准确地称取_________。(3)溶化：
各种成分
各种成分
(4)灭菌：
(5)倒平板：待培养基冷却至___ ℃左右时，在___________附近倒平板。
50
酒精灯火焰
4.纯化大肠杆菌：(1)菌落：由_________繁殖而来的肉眼可见的_______群体。(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：在培养基上得到___________________的肉眼可见的_____，即可获得较纯的_____。②纯化大肠杆菌的关键步骤：_____。
一个细胞
子细胞
由一个细胞繁殖而来
菌落
菌种
接种
③常用的微生物接种方法有两种。a.平板划线法：通过_______在琼脂固体培养基表面_________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。如图所示
接种环
连续划线
b._____________法：将菌液进行一系列的_________，然后将___________的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释涂布平板
梯度稀释
不同稀释度
5.菌种的保存方法：(1)对于频繁使用的菌种，可以采用_________的方法。(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用_________的方法。
临时保藏
甘油管藏
二、微生物的筛选与计数1.筛选菌株：(1)寻找目的菌株的方法：根据它对_________的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中微生物的筛选：①方法：_________有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。②实例：筛选尿素分解菌时使用以_____为唯一氮源的_____培养基进行培养。(3)选择培养基：在微生物学中，将允许_________的微生物生长，同时___________其他种类微生物生长的培养基。
生存环境
人为提供
选择
特定种类
抑制或阻止
尿素
2.统计菌落数目的方法：(1)_______直接计数法。①原理：利用特定___________或_____________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。
显微镜
细菌计数板
血细胞计数板
(2)间接计数法(_____计数法)。①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
活菌
②计算公式：每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。③操作：设置_______和_______，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。
重复组
对照组
30～300
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_____指示剂培养分解尿素的细菌。(2)原理：
酚红
(3)实验现象及结论。①培养基变红：该种细菌___分解尿素。②培养基不变红：该种细菌_____分解尿素。(4)统计菌落数目统计样品中的活菌一般用_____________法。(5)实验流程土壤取样→___________→微生物的培养与观察→细菌的_____。
能
不能
稀释涂布平板
样品的稀释
计数
【概念辨析】 全面清障碍1.判断下列有关微生物的实验室培养叙述的正误：(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 ( )(2)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(3)配制培养基时应先灭菌再调pH。 ( )分析：配制培养基时应先调pH再灭菌。
√
√
×
(4)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧。 ( )(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。 ( )(6)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 ( )分析：灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
√
√
×
2.判断下列有关微生物的筛选与计数叙述的正误：(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 ( )(2)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源。 ( )(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。 ( )分析：分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，氨为碱性物质，使得培养基的酸碱度升高。
√
√
×
(4)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 ( )分析：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(5)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。 ( )分析：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红(培养基的酸碱度升高，指示剂变红)，则说明筛选到分解尿素的细菌。
×
×
【概念活用】 教材命题源1.教材选修1 P16“旁栏思考题”拓展改编：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿。(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管。(3)实验操作者的双手。提示：(1)(2)需要灭菌；(3)需要消毒。
2.教材选修1 P18“旁栏”改编：微生物的接种技术除了平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。微生物接种的核心是什么？提示：防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。
3.教材选修1 P18教材改编：如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请思考：(1)图甲、图乙进行微生物接种的方法是什么？对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是什么？提示：图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用稀释涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。
(2)接种操作为什么在火焰附近进行？提示：火焰附近为无菌区域。(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是什么？提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
4.教材选修1 P29教材改编：据某微生物培养基的配方表回答下列问题：
(1)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？提示：具有选择作用。纤维素为唯一碳源，只有能分解纤维素的微生物才能生长繁殖，而不能分解纤维素的微生物被抑制。(2)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？提示：用接种了的完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照。(3)如果用该培养基来鉴别纤维素分解菌，需要加入的成分有哪些？提示：需要加入的成分有凝固剂(琼脂)和染色剂(刚果红)。
关键能力·进阶
考点一 微生物的实验室培养【典例精研引领】 (2020·江苏高考)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是___________(填编号)。
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经___________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌___________个。 (3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行____________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是____________ 。
【名师授法解题】 抓题眼练思维
【解析】本题主要考查了微生物培养的灭菌、计数、分离筛选等知识。(1)培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌，故①②③正确，错误的是④。(2)稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0 g土壤样品转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1 000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10 000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10 000=4.6×105个。
(3)根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐照，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐照处理后的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。(4)据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。
答案：(1)④ (2)梯度稀释 4.6×105(或460 000)(3)诱变 脂肪(或油脂) 较大(4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
【母题变式延伸】 核心素养新命题1.图示为采用纯化微生物培养的接种方法接种后培养的效果图，该接种方法是什么？某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？(科学思维：分析与综合)
提示：稀释涂布平板法。最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
2.如图是倒平板的操作，请据图填空(科学思维：分析与综合) (1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：_______________。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是_________。(3)丁中的操作需要等待_____________后才能进行。
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
【知能素养提升】1.消毒与灭菌的比较：(科学思维：比较、归纳)
2.平板划线操作的注意事项：(科学思维：比较、归纳)(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(3)划线时最后一区不要与第一区相连。(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如表：
【热点考向演练】考向一 结合培养基的配制和分析，考查生命观念的物质与能量观1.(2021·荆门模拟)下列有关微生物培养与应用的说法正确的是 ( )A.固体培养基中不含水，液体培养基中含水B.接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C.大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D.分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源
【解析】选C。固体培养基和液体培养基中都含有水，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成固体培养基，A错误；接种前需对培养基、培养皿、接种环等进行严格的灭菌处理，但对实验操作者的双手应该进行消毒处理，B错误；大肠杆菌纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段，C正确；要获得分解尿素的细菌，需在以尿素为唯一氮源的培养基中培养，碳源主要是糖类，D错误。
2.(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是______。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_____。 (2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会___________，其原因是_________________________。 (3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是___________。 (4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供______和______。
【解析】本题考查微生物的培养与应用的相关知识。(1)氮源是微生物生长需要的一类营养物质，是含氮化合物，可为微生物的生长提供氮元素，牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，因此在Ⅰ号培养基中，可为微生物提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨。碳源也是微生物生长所需要的一类营养物质，可为微生物的生长提供碳元素，而有机物均含碳元素，Ⅱ、Ⅲ号培养基均含有有机物X，因此，Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物的生长提供碳源的均为有机物X。(2)由于Ⅱ号培养基含有的碳源只有有机物X，所以若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌由于无法获得碳源而无法增殖导致比例下降。
(3)微生物的接种方法很多，最常用的有平板划线法与稀释涂布平板法，由于稀释涂布平板法中，稀释度足够高的菌液经涂布培养后，在培养基表面形成的一个菌落是由菌液中的一个活菌繁殖而来，所以常用来进行微生物的计数。(4)丙酮酸参与有氧呼吸的第二阶段，能被分解产生能量，且丙酮酸可作为许多物质合成的中间产物，所以它可为微生物的生长提供能量和合成其他物质的原料。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨 X(2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖(3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
【拓展延伸】1.培养基中营养物质的确定方法：不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。如：(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物(即碳源)，必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
2.选择培养基与鉴别培养基的比较：
考向二 围绕无菌技术，考查科学探究能力3.(2021·成都七中模拟)下列关于无菌操作技术的说法，正确的是 ( )A.高压蒸汽灭菌，当压力表的压力降到一个标准大气压时，就可以打开盖子B.在100 ℃煮沸5～6分钟属于灭菌方法，可杀死微生物细胞和一部分芽孢C.饮用前的鲜牛奶或使用后的液体培养基常用高压蒸汽灭菌法进行处理D.用紫外线消毒时，适量喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可以加强消毒效果
【解析】选D。高压蒸汽灭菌，只有当压力表的压力降到0时，才能打开盖子，A错误；在100 ℃煮沸5～6分钟属于消毒法，B错误；饮用前的鲜牛奶常用巴氏消毒法，C错误；用紫外线消毒时，适量喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可以加强消毒效果，D正确。
4.(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具______(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。 (2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________ 。 (3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______。在照射前，适量喷洒_________________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过_____________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。 (5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 ________________ 。
【解析】(1)玻璃和金属材质的实验器具可以通过干热灭菌的方法来灭菌。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并使牛奶的营养成分不被破坏；高温瞬时消毒是在较短的时间内利用高温杀死微生物，由于时间较短，营养物质损失较少。(3)紫外线有消毒、灭菌的作用，在照射前，适量喷洒消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水消毒通常采用“氯气”或“紫外线”等方法。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，但锅内没有达到相应温度，最可能的原因是锅内冷空气没有排尽。
答案：(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构 消毒液(4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
考向三 围绕微生物的纯化技术，考查科学思维和科学探究能力5.(2021·湖北模拟)我国《生活饮用水卫生标准》中关于生活饮用水的细菌标准的具体规定如下：细菌总数1 mL水中不超过100个，大肠杆菌数1 mL水中不超过3个。为了检验某城市自来水是否达标，某生物兴趣小组进行了相关的实验。下列有关叙述错误的是 ( )A.实验过程中应用到涂布器、移液管等操作工具B.取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样C.检验自来水中大肠杆菌数是否达标，可用稀释涂布平板法来分离并计数D.若空白对照组上有6个菌落，则在实验组数据基础上减去6，以获得最准确数据
【解析】选D。实验过程中应用到涂布器、移液管等操作工具，A正确；为避免杂菌污染，取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样，是防止温度过高杀死目的菌；B正确；稀释涂布平板法可以用于活菌计数，故检验自来水中大肠杆菌数是否达标，可用稀释涂布平板法来分离并计数，C正确；若空白对照组上有6个菌落，则说明该实验失败，实验数据不能采用，D错误。
6.某同学依据图中操作步骤，从土壤中分离以尿素为氮源的微生物。尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是( )A.尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂B.以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌C.利用液体培养基进行培养需要振荡以提高营养成分的利用率D.两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2=乙1/乙2)
【解析】选C。尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，B错误；利用液体培养基进行培养的过程中，通过振荡可以提高营养成分的利用率，C正确；两种步骤获得的菌落比值关系为(甲1/甲2>乙1/乙2)，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变多，D错误。
7. (2021年广东适应性测试)几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。某些微生物能合成几丁质酶(胞外酶)，使几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖，然后进一步转化利用。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以___________为唯一碳源的固体选择性培养基上筛选目标菌株。 (2)培养所筛选出的目标菌株，计算各单菌落周围的“水解圈直径/菌落直径“的值，比值大小反映了 _________ 。
(3)科研人员筛选出了产几丁质酶的菌株A。将菌株A发酵产生的几丁质酶粗提液加入盛有马铃薯培养基的培养皿中，涂布均匀后分别接种4种病原真菌，以________代替几丁质酶粗提液作为对照，结果如图，几丁质酶粗提液对________的抑菌效果最强(填病原菌编号)。推测几丁质酶的抑菌机理是_______________。
【解析】本题考查微生物的培养与应用。(1)在以几丁质为唯一碳源的培养基生存环境中可以选择性地筛选出目标菌株。(2)水解圈直径相对于菌落直径越大，说明菌落生活过程中对其周围培养基环境中的几丁质降解得越多，可用此指标来评估目标菌株对几丁质的降解能力。
(3)根据题意，此实验的自变量为是否加入几丁质酶，马铃薯培养基常态下无几丁质酶，加入等量无菌水的组别为对照组，而加入等量几丁质酶的组别为实验组；马铃薯培养基本身表面颜色偏暗，培养一段时间后相应菌落生长在其表面上，根据题目图示中对照组和实验组的上下对比可以看出，d组的差异最大，其实验组中的菌落直径与对照组相比明显相对更小，因此几丁质酶粗提液对拟盘多毛孢属菌的抑菌效果最强；有的微生物的细胞壁成分为几丁质，d组之所以抑菌效果明显，可能与几丁质酶破坏了拟盘多毛孢属菌的细胞壁结构有关。
答案：(1)几丁质(2)目标菌株对几丁质的降解能力 (3)等量的无菌水 d 几丁质酶通过水解真菌细胞壁，抑制真菌的繁殖
【加固训练·拔高】 1.(2020·曲靖二中一模)某研究性学习小组了解到泡菜中的乳酸菌除了在发酵中产生乳酸，还可以降解亚硝酸盐，该小组利用泡菜液进行了相关的研究。请回答下列问题：(1)乳酸菌和酵母菌在结构上的主要区别是乳酸菌_________________。(2)测定泡菜中亚硝酸盐的含量可以用______法。食物中的亚硝酸盐绝大部分随人体尿液排出，其余的在特定条件下可以转变为致癌物______。
(3)小组成员用改良的MRS固体培养基分离乳酸菌，该培养基成分如下：
①该培养基因含碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，从而在菌落周围形成溶钙圈，该培养基属于______(填“选择”或“鉴别”)培养基。
②小组成员将泡菜液进行梯度稀释后，取0.1 mL加入50 ℃左右的培养基中摇匀，待凝固后，再在其上加盖一层固体培养基。在50 ℃左右操作的原因是_______________，加盖一层固体培养基的目的是_____________。 ③在恒温培养箱中培养72 h后，挑取溶钙圈较大的菌落，用平板划线法进行进一步纯化。若图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为______。④乳酸菌在-20 ℃的冷冻箱中长期保存时，需要加入一定量的______。
【解析】(1)乳酸菌是原核生物，酵母菌是真核生物，两者的主要区别是乳酸菌没有以核膜为界限的成形的细胞核。(2)可以用比色法测定泡菜中亚硝酸盐的含量；亚硝酸盐在特定条件下可以转变为致癌物亚硝胺。
(3)①该培养基中，能够形成溶钙圈的是乳酸菌，从而将乳酸菌与其他微生物区别开来，因此该培养基属于鉴别培养基。②根据题意分析，小组成员将泡菜液进行梯度稀释后，取0.1 mL加入50 ℃左右的培养基中摇匀，因为此时培养基为液态，且该温度不烫手，便于操作；待凝固后，再在其上加盖一层固体培养基，目的是隔绝空气(氧气)，确保无氧环境。③根据题意分析，挑取溶钙圈较大的菌落，用平板划线法进一步纯化，对应丙图为正确的平板划线法。④若要长期保存乳酸菌，菌液中常需要加入一定量的甘油，且要放置在-20 ℃的冷冻箱中。
答案：(1)无以核膜为界限的细胞核(2)比色 亚硝胺(3)鉴别 此时培养基为液态且不烫手 隔绝空气(氧气)，确保无氧环境 丙 甘油
2.(2020·潍坊模拟)苯酚是含酚工业废水的主要成分，具有致癌、致畸和致突变作用。苯酚降解菌能分解工业废水中的苯酚。回答下列问题：(1)MP培养基的成分为KH2PO4 2.25 g/L，K2HPO4 2.75 g/L，(NH4)2SO4 1.0 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaCl 0.1g/L，FeCl3 0.02 g/L，CaCl2 0.01g/L。在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，应在MP培养基的基础上，前者添加______成分，后者添加______成分，然后对培养基进行灭菌，灭菌的方法为______。
(2)将等量的污泥样液均分为两份，分别接种在相同体积的MP培养基和富集培养基中，摇床振荡培养，振荡培养的目的是______________ 。两种培养中，苯酚降解菌菌体密度较低的培养基是______，原因是_____________。将富集培养基中的菌液稀释并涂布在平板上，经过一段时间的培养，在平板上长出一些形态、大小和颜色不完全相同的菌落，这说明______________。
(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为______，判断依据是 ____________________。
【解析】(1)MP培养基的成分为KH2PO4 2.25 g/L，K2HPO4 2.75 g/L，(NH4)2SO4 1.0 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，FeCl3 0.02 g/L，CaCl2 0.01 g/L。在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，应在MP培养基的基础上，前者添加苯酚成分，后者添加苯酚和琼脂成分，然后对培养基进行灭菌，灭菌的方法为高压蒸汽灭菌。
(2)将等量的污泥样液均分为两份，分别接种在相同体积的MP培养基和富集培养基中，摇床振荡培养，振荡培养的目的是使菌体与培养液、空气充分接触，利于菌体获得更多营养和氧气，利于生长。两种培养中，苯酚降解菌菌体密度较低的培养基是MP培养基，原因是MP培养基中缺少苯酚降解菌生长所需的碳源。将富集培养基中的菌液稀释并涂布在平板上，经过一段时间的培养，在平板上长出一些形态、大小和颜色不完全相同的菌落，这说明能降解苯酚的菌有多种。
(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为1.0 g/L，判断依据是此苯酚浓度下菌体繁殖快(菌体数量最多)，苯酚的降解率高(为100%)。
答案：(1)苯酚 苯酚和琼脂 高压蒸汽灭菌 (2)使菌体与培养液、空气充分接触，利于菌体获得更多营养和氧气，利于生长 MP培养基 MP培养基中缺少苯酚降解菌生长所需的碳源 能降解苯酚的菌有多种(3)1.0 g/L 此苯酚浓度下菌体繁殖快(菌体数量最多)，苯酚的降解率高(为100%)
3.(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯 酚和水，其中可作为碳源的有_______________。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。(3)如图为连续划线法示意图，在图中______(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为___________。 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释______ (填序号：①5 ②10 ③20)倍后，再进行比色。
【解析】(1)蛋白胨和苯酚都是含碳有机物，可以为酚降解菌提供碳源。(2)将采集到的样品接种培养，随转接次数增加而逐渐增加苯酚用量可以增大酚降解菌的比例，以达到富集酚降解菌的目的。如果图中平板中菌落过于密集，说明培养液中酚降解菌数量过多，需要进一步稀释后再涂布，以便于菌落计数与分离。平板培养基是固体培养基，在配制的时候除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等凝固剂。(3)因为每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，所以最后一次划线结束的时候更容易获得单菌落。(4)根据表中6号管中苯酚浓度为1 mg/L，可推知1～5号管中苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后苯酚残留液浓度在0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍。
答案：(1)蛋白胨、苯酚(2)增加 稀释涂布 凝固剂(3)③ (4) 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
考点二 微生物的筛选与计数【典例精研引领】 (2020·全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_____________。甲、乙培养基均属于___________培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释______倍。 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_______________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤 ______。 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_____________。
【名师授法解题】 抓题眼练思维
【解析】(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中③④过程可知，甲为液体培养基，乙为固体培养基，所以乙培养基中需要加入的Y为琼脂。甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，因此均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，根据计算公式：细菌细胞数=(C÷V)×M可知，稀释倍数M=2×107×V÷C=2×107÷1 000×100÷200=104(倍)。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。答案：(1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 (2)104(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长(4)取淤泥加入无菌水，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数 (5)水、碳源、氮源和无机盐
【母题变式延伸】 核心素养新命题 研究人员测定从淤泥中分离得到能高效降解S的活菌的数量为什么不能用平板划线法？(科学思维：分析与综合)提示：由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。
【备选典例】 (2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生___________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择___________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是___________________ 。 (3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有 ______________ (答出两点即可)。
【解析】本题主要考查了微生物的培养、筛选的相关知识。(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌细胞内能产生脲酶，脲酶可将尿素分解成NH3和CO2。尿素是有机物，能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物，只能利用现成的有机物。葡萄糖是生物的主要能源物质，细菌摄取葡萄糖作为碳源，可为生命活动提供能量，还可为其他有机物的合成提供原材料。
(2)筛选不同的细菌所用的培养基是选择培养基，筛选能分解尿素的细菌，可用尿素作氮源，不能分解尿素的细菌会因氮源缺乏而死亡，能存活的只有能分解尿素的细菌。若选用NH4NO3 作氮源，无论是能分解尿素的细菌还是不能分解尿素的细菌都可利用，起不到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4所含的元素是细菌生长需要的，同时这两种化合物也是缓冲物质，用于调节细菌培养过程中因代谢物生成后pH发生的改变，维持了细菌生活环境pH的相对稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原材料(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH稳定
【知能素养提升】1.微生物的筛选与鉴别方法：(科学思维：分析与综合)(1)微生物的筛选方法：
(2)微生物的鉴别方法：
2.常用的选择培养基与鉴别培养基：(科学思维：分析与综合)
【热点考向演练】考向一 结合选择培养基的成分及配制，考查实验探究和科学思维能力1.(2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是 ( )A.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC.酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D.适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
【解析】选A。本题主要考查微生物的培养条件和应用。尿素固体培养基上，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非迅速杀死其他微生物，A项错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配制培养基时，应根据微生物的种类调整培养基的pH，B项正确；酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C项正确；醋化醋杆菌在有氧条件下能利用酒精产生醋酸，所以适宜浓度的酒精可以使醋化醋杆菌活化，D项正确。
2.(2021·房山模拟)拟从餐厨垃圾中分离具有高效降解能力的微生物制成菌剂，用于餐厨垃圾高效无害化处理。配制用于培养菌种的培养基(如表)，为比较这些菌种的降解效果，分别配制含有餐厨垃圾主要成分(淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素)的培养基，检测效果如图。相关说法不正确的是 ( )培养菌种所用培养基
A.根据配方可知，该培养基属于固体培养基B.在涂布过程中需要用到涂布器和酒精灯C.透明圈表示菌种可降解培养基中含有的餐厨垃圾成分D.D0/D的值越大，说明菌种的降解效果越好
【解析】选D。该培养基中含有琼脂，所以该培养基是固体培养基，A正确；该平板中菌落分布均匀，采用的接种方法是稀释涂布平板法，所以需要用到涂布器和酒精灯，B正确；根据题干信息可知培养基中含有餐厨垃圾的成分，而微生物将这些成分降解后，可以产生透明圈，C正确；D0是菌落直径，D是透明圈大小，所以D0/D的值越小，说明菌种的降解效果越好，D错误。
3.(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是______(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是____________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_______(填“能够”或“不能”)生长，原因是_______________。 (2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。 (3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是___________________。 (4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过___________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【解析】(1)蛋白胨含有C、H、O、N等元素，葡萄糖只含有C、H、O，NaNO3不含有C，所以培养基中蛋白胨能同时提供碳源和氮源。不同细菌生长繁殖所需要的pH不同，因此培养不同的细菌，需要调节培养基至不同pH。硝化细菌属于化能自养型细菌，可以将空气中的二氧化碳等无机物合成为有机物，它可以在没有碳源的培养基上生长。 (2)用平板培养基培养细菌时，一般需要将平板倒置，以防止培养皿盖上凝结的水珠滴落，导致污染。
(3)不同种的微生物在一定条件下培养，可在培养基上形成大小、颜色、形状等不同的菌落，这是一种比较稳定的特征，可根据菌落的特征区分不同种的微生物。(4)使用后的培养基需要用强烈的物理或化学手段进行灭菌，以杀灭其中所有的微生物，避免污染环境。
答案：(1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置 (3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 (4)灭菌
考向二 结合微生物的分离与计数的实验实例，考查实验探究和科学思维能力4.(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是 ( )A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【解析】选B。本题主要考查平板划线法的相关使用技巧。倒平板后不需要晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
考向三 围绕分解尿素的细菌的分离与计数实验，考查科学思维和科学探究能力5.(2021·河北模拟)尿素分解菌可将土壤中的尿素分解成CO2和NH3供植物利用。下列关于土壤中尿素分解菌的分离和计数的叙述，错误的是 ( )A.尿素分解菌能分解尿素是因为能合成脲酶B.培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性C.用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌D.若用稀释涂布平板法计数，统计的细菌数往往比活菌的实际数目多
【解析】选D。尿素分解菌可以合成脲酶，将尿素分解成CO2和NH3，A正确；培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性，B正确；用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌，C正确；由于两个或多个细菌可能形成一个菌落，所以用稀释涂布平板法计数，统计的数目比实际的数目少，D错误。
【加固训练·拔高】 1.(2020·通辽模拟)测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基(EMB培养基)上长出的菌落呈黑色，如图所示；滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目。据图回答问题。
(1)与过滤有关的操作都要在______旁进行。(2)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为 ________ 。(3)将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的_____操作。从功能上看，EMB培养基属于______培养基。(4)无菌操作下将90 mL无菌水加入10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了_____倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数为45，黑色菌落为5，则1升待测水样中的大肠杆菌数目为_________个。(5)若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径__________(填“更大”或“更小”)的滤膜。
【解析】(1)在实验操作过程中，为避免杂菌的污染，与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行。(2)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，此时可以在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上。(3)过滤后水样中的细菌留在滤膜上，因此将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，属于微生物培养中的接种操作。从功能上看，该培养基中含有伊红美蓝，因此EMB培养基属于鉴别培养基。
(4)无菌操作下将90 mL无菌水加入10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍；根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目=5×(1 000÷10)=500个。(5)若要测定待测水样中酵母菌的数目，酵母菌属于真核生物，大肠杆菌属于原核生物，真核细胞的直径比原核细胞大，因此应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径更大的滤膜。
答案：(1)酒精灯火焰(2)在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤(3)接种 鉴别 (4)10 500 (5)更大
2.(2020·南京模拟)水产或家畜养殖污水中含有大量的类固醇，而这类化合物会对人体造成危害，且不易被降解，而丛毛单胞菌是目前用于降解这类有机污染物常用的需氧型菌种。由于抗生素的滥用，污水中含有大量的抗生素残余，这些抗生素会强烈地抑制丛毛单胞菌的作用，从而降低污水处理的效果。结合所学知识，回答下列问题：(1)从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样，其原因是_________ 。(2)筛选丛毛单胞菌时，通常以______为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备这一培养基的一般步骤包括计算、称量、溶化、______、倒平板。
(3)研究人员从含抗生素的污水中分离出了3个抗生素耐药型丛毛单胞菌菌株(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)为了测试其在高浓度抗生素条件下的增殖能力，他们进行了如下实验：①将等量的三种菌株，分别接种到添加了高浓度抗生素和一定量类固醇物质的细菌液体培养基中，测量计算初始培养液中种群密度的相对值，之后不断通入无菌空气，在适宜的条件下进行培养；②接种培养开始后100小时内，每20小时取样一次，每次每种菌株重复3次计数，常利用______法接种进行活菌数的测定，从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为______。在测定菌群密度相对值的同时，每次取样还要测定菌液中固醇类物质的浓度。
③下面的曲线图是根据实验过程中所获得的数据绘制而成。
a.与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，造成菌株Ⅰ种群密度下降的原因有______(填序号)。①种内斗争加剧 ②营养物质积累 ③营养物质消耗 ④代谢废物消耗b.从污水处理的角度分析及研究数据来看，菌株______更适合作为污水中类固醇污染物的处理，理由是___________。
【解析】(1)由于鱼塘废水或附近土壤中类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌，所以从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样。(2)根据选择培养基的作用筛选丛毛单胞菌时，通常以类固醇为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
(3)②在对菌种进行分离与计数时常利用稀释涂布平板法接种进行活菌数的测定；根据题中的操作信息，三种菌株，100小时内每20小时取样一次，共取样5次，每次每种菌株重复3次计数，因此从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为45次。③与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，菌株Ⅰ种群密度大幅下降，推测可能的原因是：随着种群数量的增多及营养物质的消耗，种内斗争加剧，以及有害代谢废物的积累等。根据图甲及图乙中的数据综合分析，在实验时间内，菌株Ⅱ种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强，因此其更适合作为污水中类固醇污染物的处理。
答案：(1)这些区域内类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌(2)类固醇 (调pH、)灭菌(3)稀释涂布平板 45 ①③ Ⅱ 在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强
3.(2020·马鞍山一模)尿素是一种重要的农业氮肥，但是并不能直接被农作物吸收。土壤中含大量微生物，其中就有尿素分解菌。某兴趣小组欲从土壤中分离该类细菌，并进行后续培养研究，设计如下实验：
请回答有关问题：(1)称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是______。(2)该兴趣小组设计了A、B两种培养基(成分见表)： 注：+表示有，-表示无
据表分析，两种培养基的碳源是______；培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化，原因是______。接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察____进行初步鉴定。(3)加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是________。配制好的培养基灭菌方法是______。(4)若用平板划线法接种微生物，在培养基上共划了4个区域，则至少需要______次灼烧接种环。
【解析】(1)微生物培养的关键是无菌操作，称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是防止杂菌污染。 (2)由表可知，两种培养基的碳源是葡萄糖；培养基A和培养基B的区别是有无琼脂，即培养基A为固体培养基，培养基B为液体培养基，分离微生物需要用固体培养基，故培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化。由鉴定分解尿素细菌的原理可知，接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察培养基是否变红进行初步鉴定。
(3)加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是为细菌生长提供营养物质，调节pH。培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。(4)采用平板划线法纯化微生物时，每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后还需灼烧接种环，若划线时在培养基上共划了4个区域，则需要5次灼烧接种环。
答案：(1)防止空气中的杂菌污染(2)葡萄糖 分离微生物需要用固体培养基或液体培养基不能用于分离纯化 培养基是否变红(培养基颜色) (3)为细菌生长提供营养物质，调节pH 高压蒸汽灭菌法 (4)5
4.(2020·丹东模拟)研究发现，牛的瘤胃中含有多种纤维素分解菌，这些纤维素分解菌可用于分解秸秆等废弃物。某科研小组按以下实验流程分离获取了牛瘤胃中的纤维素酶高产菌株。
(1)纤维素酶是由多种酶组成的复合酶，其中能催化纤维二糖水解的是_____。纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的_____进行定量测定。(2)步骤A是______，可以通过此步骤增加______。(3)科研小组的某个同学将瘤胃菌种提取液接种到适宜的培养液中，调节pH及温度至适宜条件，并持续通入无菌空气，结果一段时间后发现培养液中几乎没有菌种，原因是 _______________。
(4)按照修正后的实验方法，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明圈的菌落(如图)。图中透明圈的大小与纤维素酶的______有关；图中降解纤维素能力最强的菌株是______。
(5)现利用稀释涂布平板法测定该目的菌的数量，在同一稀释倍数下4个平板上均接种0.1 mL样品溶液，菌落数分别为156、178、486、191，通过计算得知原样品溶液中每毫升含有目的菌1.75×108个，则稀释倍数是___________。
【解析】(1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种，其中能够将纤维二糖分解为葡萄糖的是葡萄糖苷酶。一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。(2)牛胃取样后，使用选择培养基选择培养，目的是增加纤维素分解菌(或目的菌)的浓度，因此步骤A是选择培养。(3)由于瘤胃中的微生物为厌氧型，不能在有氧环境中生存、繁殖，所以将瘤胃菌种提取液接种到适宜的培养液中，调节pH及温度至适宜条件，并持续通入无菌空气，一段时间后发现培养液中几乎没有菌种。
(4)按照修正后的实验方法，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明圈的菌落(如图)。图中透明圈的大小可以反映纤维素分解菌产生的酶的多少(产量)及酶的活性；图中菌2周围的透明圈最大，降解纤维素能力最强。 (5)用于计数细菌菌落的常用方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克该土壤样品中的菌落数对应的应该是每毫升菌液中的细菌数目，所以每克该土壤样品中的菌落数为(156+178+191)÷3÷0.1×稀释倍数=1.75×108，因此稀释倍数= 105。
答案：(1)葡萄糖苷酶 葡萄糖(2)选择培养 纤维素分解菌的浓度(3)瘤胃中的微生物为厌氧型，不能在有氧环境中生存、繁殖(4)产量和活性 菌2(5)105
【拓展视野】 选择培养基的作用原理(1)在培养基中加入某种化学物质，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在满足基本所需培养成分的基础上加入的。(2)改变培养基中的营养成分，如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件，如将培养基放在高温环境中可以得到耐高温的微生物。
第2课 微生物的培养与应用
核心概念·自查
【概念导图】 一图知全局
【概念梳理】 闭书测基础一、微生物的实验室培养1.培养基：(1)概念：人们按照微生物对_________的不同需求，配制出供其_________的营养基质。(2)营养组成：一般都含有_______________和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对___、_____________以及氧气的要求。(3)种类①按照物理性质可分为_____培养基、固体培养基、半固体培养基。②按照成分的来源可分为天然培养基和_____培养基。③按照功能用途可分为选择培养基、_____培养基等。
营养物质
生长繁殖
水、碳源、氮源
pH
特殊营养物质
液体
合成
鉴别
2.无菌技术：(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止_________的方法。(2)关键：防止_________的入侵。(3)连线无菌技术的常用方法及适用对象
杂菌污染
外来杂菌
3.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：(1)计算：依据配方比例，计算配制100 mL的培养基时，_________的用量。(2)称量：准确地称取_________。(3)溶化：
各种成分
各种成分
(4)灭菌：
(5)倒平板：待培养基冷却至___ ℃左右时，在___________附近倒平板。
50
酒精灯火焰
4.纯化大肠杆菌：(1)菌落：由_________繁殖而来的肉眼可见的_______群体。(2)纯化大肠杆菌的方法①纯化培养原理：在培养基上得到___________________的肉眼可见的_____，即可获得较纯的_____。②纯化大肠杆菌的关键步骤：_____。
一个细胞
子细胞
由一个细胞繁殖而来
菌落
菌种
接种
③常用的微生物接种方法有两种。a.平板划线法：通过_______在琼脂固体培养基表面_________的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。如图所示
接种环
连续划线
b._____________法：将菌液进行一系列的_________，然后将___________的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释涂布平板
梯度稀释
不同稀释度
5.菌种的保存方法：(1)对于频繁使用的菌种，可以采用_________的方法。(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用_________的方法。
临时保藏
甘油管藏
二、微生物的筛选与计数1.筛选菌株：(1)寻找目的菌株的方法：根据它对_________的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中微生物的筛选：①方法：_________有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。②实例：筛选尿素分解菌时使用以_____为唯一氮源的_____培养基进行培养。(3)选择培养基：在微生物学中，将允许_________的微生物生长，同时___________其他种类微生物生长的培养基。
生存环境
人为提供
选择
特定种类
抑制或阻止
尿素
2.统计菌落数目的方法：(1)_______直接计数法。①原理：利用特定___________或_____________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。
显微镜
细菌计数板
血细胞计数板
(2)间接计数法(_____计数法)。①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
活菌
②计算公式：每克样品中的菌株数=(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。③操作：设置_______和_______，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。
重复组
对照组
30～300
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_____指示剂培养分解尿素的细菌。(2)原理：
酚红
(3)实验现象及结论。①培养基变红：该种细菌___分解尿素。②培养基不变红：该种细菌_____分解尿素。(4)统计菌落数目统计样品中的活菌一般用_____________法。(5)实验流程土壤取样→___________→微生物的培养与观察→细菌的_____。
能
不能
稀释涂布平板
样品的稀释
计数
【概念辨析】 全面清障碍1.判断下列有关微生物的实验室培养叙述的正误：(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。 ( )(2)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。( )(3)配制培养基时应先灭菌再调pH。 ( )分析：配制培养基时应先调pH再灭菌。
√
√
×
(4)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧。 ( )(5)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。 ( )(6)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 ( )分析：灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
√
√
×
2.判断下列有关微生物的筛选与计数叙述的正误：(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 ( )(2)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源。 ( )(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。 ( )分析：分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，氨为碱性物质，使得培养基的酸碱度升高。
√
√
×
(4)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 ( )分析：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(5)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。 ( )分析：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红(培养基的酸碱度升高，指示剂变红)，则说明筛选到分解尿素的细菌。
×
×
【概念活用】 教材命题源1.教材选修1 P16“旁栏思考题”拓展改编：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿。(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管。(3)实验操作者的双手。提示：(1)(2)需要灭菌；(3)需要消毒。
2.教材选修1 P18“旁栏”改编：微生物的接种技术除了平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。微生物接种的核心是什么？提示：防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。
3.教材选修1 P18教材改编：如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请思考：(1)图甲、图乙进行微生物接种的方法是什么？对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是什么？提示：图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用稀释涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。
(2)接种操作为什么在火焰附近进行？提示：火焰附近为无菌区域。(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是什么？提示：防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
4.教材选修1 P29教材改编：据某微生物培养基的配方表回答下列问题：
(1)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？提示：具有选择作用。纤维素为唯一碳源，只有能分解纤维素的微生物才能生长繁殖，而不能分解纤维素的微生物被抑制。(2)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？提示：用接种了的完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照。(3)如果用该培养基来鉴别纤维素分解菌，需要加入的成分有哪些？提示：需要加入的成分有凝固剂(琼脂)和染色剂(刚果红)。
关键能力·进阶
考点一 微生物的实验室培养【典例精研引领】 (2020·江苏高考)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是___________(填编号)。
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经___________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌___________个。 (3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行____________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是____________ 。
【名师授法解题】 抓题眼练思维
【解析】本题主要考查了微生物培养的灭菌、计数、分离筛选等知识。(1)培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌，故①②③正确，错误的是④。(2)稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0 g土壤样品转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1 000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10 000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10 000=4.6×105个。
(3)根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐照，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐照处理后的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。(4)据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。
答案：(1)④ (2)梯度稀释 4.6×105(或460 000)(3)诱变 脂肪(或油脂) 较大(4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
【母题变式延伸】 核心素养新命题1.图示为采用纯化微生物培养的接种方法接种后培养的效果图，该接种方法是什么？某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？(科学思维：分析与综合)
提示：稀释涂布平板法。最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
2.如图是倒平板的操作，请据图填空(科学思维：分析与综合) (1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：_______________。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是_________。(3)丁中的操作需要等待_____________后才能进行。
丙→乙→甲→丁
灼烧灭菌
平板冷却凝固
【知能素养提升】1.消毒与灭菌的比较：(科学思维：比较、归纳)
2.平板划线操作的注意事项：(科学思维：比较、归纳)(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(3)划线时最后一区不要与第一区相连。(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如表：
【热点考向演练】考向一 结合培养基的配制和分析，考查生命观念的物质与能量观1.(2021·荆门模拟)下列有关微生物培养与应用的说法正确的是 ( )A.固体培养基中不含水，液体培养基中含水B.接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理C.大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段D.分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源
【解析】选C。固体培养基和液体培养基中都含有水，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成固体培养基，A错误；接种前需对培养基、培养皿、接种环等进行严格的灭菌处理，但对实验操作者的双手应该进行消毒处理，B错误；大肠杆菌纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段，C正确；要获得分解尿素的细菌，需在以尿素为唯一氮源的培养基中培养，碳源主要是糖类，D错误。
2.(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是______。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_____。 (2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会___________，其原因是_________________________。 (3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是___________。 (4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供______和______。
【解析】本题考查微生物的培养与应用的相关知识。(1)氮源是微生物生长需要的一类营养物质，是含氮化合物，可为微生物的生长提供氮元素，牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，因此在Ⅰ号培养基中，可为微生物提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨。碳源也是微生物生长所需要的一类营养物质，可为微生物的生长提供碳元素，而有机物均含碳元素，Ⅱ、Ⅲ号培养基均含有有机物X，因此，Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物的生长提供碳源的均为有机物X。(2)由于Ⅱ号培养基含有的碳源只有有机物X，所以若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌由于无法获得碳源而无法增殖导致比例下降。
(3)微生物的接种方法很多，最常用的有平板划线法与稀释涂布平板法，由于稀释涂布平板法中，稀释度足够高的菌液经涂布培养后，在培养基表面形成的一个菌落是由菌液中的一个活菌繁殖而来，所以常用来进行微生物的计数。(4)丙酮酸参与有氧呼吸的第二阶段，能被分解产生能量，且丙酮酸可作为许多物质合成的中间产物，所以它可为微生物的生长提供能量和合成其他物质的原料。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨 X(2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖(3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
【拓展延伸】1.培养基中营养物质的确定方法：不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。如：(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物(即碳源)，必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
2.选择培养基与鉴别培养基的比较：
考向二 围绕无菌技术，考查科学探究能力3.(2021·成都七中模拟)下列关于无菌操作技术的说法，正确的是 ( )A.高压蒸汽灭菌，当压力表的压力降到一个标准大气压时，就可以打开盖子B.在100 ℃煮沸5～6分钟属于灭菌方法，可杀死微生物细胞和一部分芽孢C.饮用前的鲜牛奶或使用后的液体培养基常用高压蒸汽灭菌法进行处理D.用紫外线消毒时，适量喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可以加强消毒效果
【解析】选D。高压蒸汽灭菌，只有当压力表的压力降到0时，才能打开盖子，A错误；在100 ℃煮沸5～6分钟属于消毒法，B错误；饮用前的鲜牛奶常用巴氏消毒法，C错误；用紫外线消毒时，适量喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液可以加强消毒效果，D正确。
4.(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具______(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。 (2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________ 。 (3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______。在照射前，适量喷洒_________________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过_____________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。 (5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 ________________ 。
【解析】(1)玻璃和金属材质的实验器具可以通过干热灭菌的方法来灭菌。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并使牛奶的营养成分不被破坏；高温瞬时消毒是在较短的时间内利用高温杀死微生物，由于时间较短，营养物质损失较少。(3)紫外线有消毒、灭菌的作用，在照射前，适量喷洒消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水消毒通常采用“氯气”或“紫外线”等方法。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，但锅内没有达到相应温度，最可能的原因是锅内冷空气没有排尽。
答案：(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构 消毒液(4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
考向三 围绕微生物的纯化技术，考查科学思维和科学探究能力5.(2021·湖北模拟)我国《生活饮用水卫生标准》中关于生活饮用水的细菌标准的具体规定如下：细菌总数1 mL水中不超过100个，大肠杆菌数1 mL水中不超过3个。为了检验某城市自来水是否达标，某生物兴趣小组进行了相关的实验。下列有关叙述错误的是 ( )A.实验过程中应用到涂布器、移液管等操作工具B.取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样C.检验自来水中大肠杆菌数是否达标，可用稀释涂布平板法来分离并计数D.若空白对照组上有6个菌落，则在实验组数据基础上减去6，以获得最准确数据
【解析】选D。实验过程中应用到涂布器、移液管等操作工具，A正确；为避免杂菌污染，取样水龙头应用火焰灼烧，打开水龙头一段时间后再取样，是防止温度过高杀死目的菌；B正确；稀释涂布平板法可以用于活菌计数，故检验自来水中大肠杆菌数是否达标，可用稀释涂布平板法来分离并计数，C正确；若空白对照组上有6个菌落，则说明该实验失败，实验数据不能采用，D错误。
6.某同学依据图中操作步骤，从土壤中分离以尿素为氮源的微生物。尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是( )A.尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂B.以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌C.利用液体培养基进行培养需要振荡以提高营养成分的利用率D.两种步骤获得的菌落比值相等(甲1/甲2=乙1/乙2)
【解析】选C。尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，B错误；利用液体培养基进行培养的过程中，通过振荡可以提高营养成分的利用率，C正确；两种步骤获得的菌落比值关系为(甲1/甲2>乙1/乙2)，因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变多，D错误。
7. (2021年广东适应性测试)几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。某些微生物能合成几丁质酶(胞外酶)，使几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖，然后进一步转化利用。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以___________为唯一碳源的固体选择性培养基上筛选目标菌株。 (2)培养所筛选出的目标菌株，计算各单菌落周围的“水解圈直径/菌落直径“的值，比值大小反映了 _________ 。
(3)科研人员筛选出了产几丁质酶的菌株A。将菌株A发酵产生的几丁质酶粗提液加入盛有马铃薯培养基的培养皿中，涂布均匀后分别接种4种病原真菌，以________代替几丁质酶粗提液作为对照，结果如图，几丁质酶粗提液对________的抑菌效果最强(填病原菌编号)。推测几丁质酶的抑菌机理是_______________。
【解析】本题考查微生物的培养与应用。(1)在以几丁质为唯一碳源的培养基生存环境中可以选择性地筛选出目标菌株。(2)水解圈直径相对于菌落直径越大，说明菌落生活过程中对其周围培养基环境中的几丁质降解得越多，可用此指标来评估目标菌株对几丁质的降解能力。
(3)根据题意，此实验的自变量为是否加入几丁质酶，马铃薯培养基常态下无几丁质酶，加入等量无菌水的组别为对照组，而加入等量几丁质酶的组别为实验组；马铃薯培养基本身表面颜色偏暗，培养一段时间后相应菌落生长在其表面上，根据题目图示中对照组和实验组的上下对比可以看出，d组的差异最大，其实验组中的菌落直径与对照组相比明显相对更小，因此几丁质酶粗提液对拟盘多毛孢属菌的抑菌效果最强；有的微生物的细胞壁成分为几丁质，d组之所以抑菌效果明显，可能与几丁质酶破坏了拟盘多毛孢属菌的细胞壁结构有关。
答案：(1)几丁质(2)目标菌株对几丁质的降解能力 (3)等量的无菌水 d 几丁质酶通过水解真菌细胞壁，抑制真菌的繁殖
【加固训练·拔高】 1.(2020·曲靖二中一模)某研究性学习小组了解到泡菜中的乳酸菌除了在发酵中产生乳酸，还可以降解亚硝酸盐，该小组利用泡菜液进行了相关的研究。请回答下列问题：(1)乳酸菌和酵母菌在结构上的主要区别是乳酸菌_________________。(2)测定泡菜中亚硝酸盐的含量可以用______法。食物中的亚硝酸盐绝大部分随人体尿液排出，其余的在特定条件下可以转变为致癌物______。
(3)小组成员用改良的MRS固体培养基分离乳酸菌，该培养基成分如下：
①该培养基因含碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙，从而在菌落周围形成溶钙圈，该培养基属于______(填“选择”或“鉴别”)培养基。
②小组成员将泡菜液进行梯度稀释后，取0.1 mL加入50 ℃左右的培养基中摇匀，待凝固后，再在其上加盖一层固体培养基。在50 ℃左右操作的原因是_______________，加盖一层固体培养基的目的是_____________。 ③在恒温培养箱中培养72 h后，挑取溶钙圈较大的菌落，用平板划线法进行进一步纯化。若图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为______。④乳酸菌在-20 ℃的冷冻箱中长期保存时，需要加入一定量的______。
【解析】(1)乳酸菌是原核生物，酵母菌是真核生物，两者的主要区别是乳酸菌没有以核膜为界限的成形的细胞核。(2)可以用比色法测定泡菜中亚硝酸盐的含量；亚硝酸盐在特定条件下可以转变为致癌物亚硝胺。
(3)①该培养基中，能够形成溶钙圈的是乳酸菌，从而将乳酸菌与其他微生物区别开来，因此该培养基属于鉴别培养基。②根据题意分析，小组成员将泡菜液进行梯度稀释后，取0.1 mL加入50 ℃左右的培养基中摇匀，因为此时培养基为液态，且该温度不烫手，便于操作；待凝固后，再在其上加盖一层固体培养基，目的是隔绝空气(氧气)，确保无氧环境。③根据题意分析，挑取溶钙圈较大的菌落，用平板划线法进一步纯化，对应丙图为正确的平板划线法。④若要长期保存乳酸菌，菌液中常需要加入一定量的甘油，且要放置在-20 ℃的冷冻箱中。
答案：(1)无以核膜为界限的细胞核(2)比色 亚硝胺(3)鉴别 此时培养基为液态且不烫手 隔绝空气(氧气)，确保无氧环境 丙 甘油
2.(2020·潍坊模拟)苯酚是含酚工业废水的主要成分，具有致癌、致畸和致突变作用。苯酚降解菌能分解工业废水中的苯酚。回答下列问题：(1)MP培养基的成分为KH2PO4 2.25 g/L，K2HPO4 2.75 g/L，(NH4)2SO4 1.0 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaCl 0.1g/L，FeCl3 0.02 g/L，CaCl2 0.01g/L。在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，应在MP培养基的基础上，前者添加______成分，后者添加______成分，然后对培养基进行灭菌，灭菌的方法为______。
(2)将等量的污泥样液均分为两份，分别接种在相同体积的MP培养基和富集培养基中，摇床振荡培养，振荡培养的目的是______________ 。两种培养中，苯酚降解菌菌体密度较低的培养基是______，原因是_____________。将富集培养基中的菌液稀释并涂布在平板上，经过一段时间的培养，在平板上长出一些形态、大小和颜色不完全相同的菌落，这说明______________。
(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为______，判断依据是 ____________________。
【解析】(1)MP培养基的成分为KH2PO4 2.25 g/L，K2HPO4 2.75 g/L，(NH4)2SO4 1.0 g/L，MgCl2 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，FeCl3 0.02 g/L，CaCl2 0.01 g/L。在制作苯酚降解菌的富集培养基和平板分离培养基时，应在MP培养基的基础上，前者添加苯酚成分，后者添加苯酚和琼脂成分，然后对培养基进行灭菌，灭菌的方法为高压蒸汽灭菌。
(2)将等量的污泥样液均分为两份，分别接种在相同体积的MP培养基和富集培养基中，摇床振荡培养，振荡培养的目的是使菌体与培养液、空气充分接触，利于菌体获得更多营养和氧气，利于生长。两种培养中，苯酚降解菌菌体密度较低的培养基是MP培养基，原因是MP培养基中缺少苯酚降解菌生长所需的碳源。将富集培养基中的菌液稀释并涂布在平板上，经过一段时间的培养，在平板上长出一些形态、大小和颜色不完全相同的菌落，这说明能降解苯酚的菌有多种。
(3)对分离得到的某株苯酚降解菌进行菌株生长及苯酚降解实验，结果如图。实验结果表明此菌株适于降解的苯酚浓度为1.0 g/L，判断依据是此苯酚浓度下菌体繁殖快(菌体数量最多)，苯酚的降解率高(为100%)。
答案：(1)苯酚 苯酚和琼脂 高压蒸汽灭菌 (2)使菌体与培养液、空气充分接触，利于菌体获得更多营养和氧气，利于生长 MP培养基 MP培养基中缺少苯酚降解菌生长所需的碳源 能降解苯酚的菌有多种(3)1.0 g/L 此苯酚浓度下菌体繁殖快(菌体数量最多)，苯酚的降解率高(为100%)
3.(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯 酚和水，其中可作为碳源的有_______________。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。(3)如图为连续划线法示意图，在图中______(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为___________。 如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释______ (填序号：①5 ②10 ③20)倍后，再进行比色。
【解析】(1)蛋白胨和苯酚都是含碳有机物，可以为酚降解菌提供碳源。(2)将采集到的样品接种培养，随转接次数增加而逐渐增加苯酚用量可以增大酚降解菌的比例，以达到富集酚降解菌的目的。如果图中平板中菌落过于密集，说明培养液中酚降解菌数量过多，需要进一步稀释后再涂布，以便于菌落计数与分离。平板培养基是固体培养基，在配制的时候除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等凝固剂。(3)因为每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，所以最后一次划线结束的时候更容易获得单菌落。(4)根据表中6号管中苯酚浓度为1 mg/L，可推知1～5号管中苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后苯酚残留液浓度在0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍。
答案：(1)蛋白胨、苯酚(2)增加 稀释涂布 凝固剂(3)③ (4) 0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
考点二 微生物的筛选与计数【典例精研引领】 (2020·全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_____________。甲、乙培养基均属于___________培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL 稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释______倍。 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_______________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤 ______。 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即_____________。
【名师授法解题】 抓题眼练思维
【解析】(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中③④过程可知，甲为液体培养基，乙为固体培养基，所以乙培养基中需要加入的Y为琼脂。甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，因此均属于选择培养基。(2)若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，根据计算公式：细菌细胞数=(C÷V)×M可知，稀释倍数M=2×107×V÷C=2×107÷1 000×100÷200=104(倍)。(3)当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。答案：(1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择 (2)104(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长(4)取淤泥加入无菌水，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数 (5)水、碳源、氮源和无机盐
【母题变式延伸】 核心素养新命题 研究人员测定从淤泥中分离得到能高效降解S的活菌的数量为什么不能用平板划线法？(科学思维：分析与综合)提示：由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。
【备选典例】 (2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生___________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择___________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是___________________ 。 (3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有 ______________ (答出两点即可)。
【解析】本题主要考查了微生物的培养、筛选的相关知识。(1)有些细菌能分解尿素是因为这些细菌细胞内能产生脲酶，脲酶可将尿素分解成NH3和CO2。尿素是有机物，能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物，只能利用现成的有机物。葡萄糖是生物的主要能源物质，细菌摄取葡萄糖作为碳源，可为生命活动提供能量，还可为其他有机物的合成提供原材料。
(2)筛选不同的细菌所用的培养基是选择培养基，筛选能分解尿素的细菌，可用尿素作氮源，不能分解尿素的细菌会因氮源缺乏而死亡，能存活的只有能分解尿素的细菌。若选用NH4NO3 作氮源，无论是能分解尿素的细菌还是不能分解尿素的细菌都可利用，起不到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4所含的元素是细菌生长需要的，同时这两种化合物也是缓冲物质，用于调节细菌培养过程中因代谢物生成后pH发生的改变，维持了细菌生活环境pH的相对稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原材料(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH稳定
【知能素养提升】1.微生物的筛选与鉴别方法：(科学思维：分析与综合)(1)微生物的筛选方法：
(2)微生物的鉴别方法：
2.常用的选择培养基与鉴别培养基：(科学思维：分析与综合)
【热点考向演练】考向一 结合选择培养基的成分及配制，考查实验探究和科学思维能力1.(2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是 ( )A.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC.酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D.适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化
【解析】选A。本题主要考查微生物的培养条件和应用。尿素固体培养基上，由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖，而保留利用尿素的微生物，并非迅速杀死其他微生物，A项错误；不同的微生物所需的pH不同，所以配制培养基时，应根据微生物的种类调整培养基的pH，B项正确；酵母菌不能直接利用淀粉，应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化，再用酵母菌发酵得到糯米酒，C项正确；醋化醋杆菌在有氧条件下能利用酒精产生醋酸，所以适宜浓度的酒精可以使醋化醋杆菌活化，D项正确。
2.(2021·房山模拟)拟从餐厨垃圾中分离具有高效降解能力的微生物制成菌剂，用于餐厨垃圾高效无害化处理。配制用于培养菌种的培养基(如表)，为比较这些菌种的降解效果，分别配制含有餐厨垃圾主要成分(淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素)的培养基，检测效果如图。相关说法不正确的是 ( )培养菌种所用培养基
A.根据配方可知，该培养基属于固体培养基B.在涂布过程中需要用到涂布器和酒精灯C.透明圈表示菌种可降解培养基中含有的餐厨垃圾成分D.D0/D的值越大，说明菌种的降解效果越好
【解析】选D。该培养基中含有琼脂，所以该培养基是固体培养基，A正确；该平板中菌落分布均匀，采用的接种方法是稀释涂布平板法，所以需要用到涂布器和酒精灯，B正确；根据题干信息可知培养基中含有餐厨垃圾的成分，而微生物将这些成分降解后，可以产生透明圈，C正确；D0是菌落直径，D是透明圈大小，所以D0/D的值越小，说明菌种的降解效果越好，D错误。
3.(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是______(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是____________。硝化细菌在没有碳源的培养基上_______(填“能够”或“不能”)生长，原因是_______________。 (2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。 (3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是___________________。 (4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过___________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【解析】(1)蛋白胨含有C、H、O、N等元素，葡萄糖只含有C、H、O，NaNO3不含有C，所以培养基中蛋白胨能同时提供碳源和氮源。不同细菌生长繁殖所需要的pH不同，因此培养不同的细菌，需要调节培养基至不同pH。硝化细菌属于化能自养型细菌，可以将空气中的二氧化碳等无机物合成为有机物，它可以在没有碳源的培养基上生长。 (2)用平板培养基培养细菌时，一般需要将平板倒置，以防止培养皿盖上凝结的水珠滴落，导致污染。
(3)不同种的微生物在一定条件下培养，可在培养基上形成大小、颜色、形状等不同的菌落，这是一种比较稳定的特征，可根据菌落的特征区分不同种的微生物。(4)使用后的培养基需要用强烈的物理或化学手段进行灭菌，以杀灭其中所有的微生物，避免污染环境。
答案：(1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置 (3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 (4)灭菌
考向二 结合微生物的分离与计数的实验实例，考查实验探究和科学思维能力4.(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是 ( )A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【解析】选B。本题主要考查平板划线法的相关使用技巧。倒平板后不需要晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
考向三 围绕分解尿素的细菌的分离与计数实验，考查科学思维和科学探究能力5.(2021·河北模拟)尿素分解菌可将土壤中的尿素分解成CO2和NH3供植物利用。下列关于土壤中尿素分解菌的分离和计数的叙述，错误的是 ( )A.尿素分解菌能分解尿素是因为能合成脲酶B.培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性C.用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌D.若用稀释涂布平板法计数，统计的细菌数往往比活菌的实际数目多
【解析】选D。尿素分解菌可以合成脲酶，将尿素分解成CO2和NH3，A正确；培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性，B正确；用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌，C正确；由于两个或多个细菌可能形成一个菌落，所以用稀释涂布平板法计数，统计的数目比实际的数目少，D错误。
【加固训练·拔高】 1.(2020·通辽模拟)测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基(EMB培养基)上长出的菌落呈黑色，如图所示；滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基上培养→统计菌落数目。据图回答问题。
(1)与过滤有关的操作都要在______旁进行。(2)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为 ________ 。(3)将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的_____操作。从功能上看，EMB培养基属于______培养基。(4)无菌操作下将90 mL无菌水加入10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了_____倍，将稀释后的菌液通过滤膜法测得EMB培养基上的菌落数为45，黑色菌落为5，则1升待测水样中的大肠杆菌数目为_________个。(5)若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径__________(填“更大”或“更小”)的滤膜。
【解析】(1)在实验操作过程中，为避免杂菌的污染，与过滤有关的操作都要在酒精灯火焰旁进行。(2)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，此时可以在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上。(3)过滤后水样中的细菌留在滤膜上，因此将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，属于微生物培养中的接种操作。从功能上看，该培养基中含有伊红美蓝，因此EMB培养基属于鉴别培养基。
(4)无菌操作下将90 mL无菌水加入10 mL待测水样中，这样就将待测水样稀释了10倍；根据大肠杆菌鉴定的原理可知，黑色菌落为大肠杆菌，因此1升待测水样中的大肠杆菌数目=5×(1 000÷10)=500个。(5)若要测定待测水样中酵母菌的数目，酵母菌属于真核生物，大肠杆菌属于原核生物，真核细胞的直径比原核细胞大，因此应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径更大的滤膜。
答案：(1)酒精灯火焰(2)在无菌条件下，用无菌水冲洗滤杯，再次过滤(3)接种 鉴别 (4)10 500 (5)更大
2.(2020·南京模拟)水产或家畜养殖污水中含有大量的类固醇，而这类化合物会对人体造成危害，且不易被降解，而丛毛单胞菌是目前用于降解这类有机污染物常用的需氧型菌种。由于抗生素的滥用，污水中含有大量的抗生素残余，这些抗生素会强烈地抑制丛毛单胞菌的作用，从而降低污水处理的效果。结合所学知识，回答下列问题：(1)从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样，其原因是_________ 。(2)筛选丛毛单胞菌时，通常以______为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备这一培养基的一般步骤包括计算、称量、溶化、______、倒平板。
(3)研究人员从含抗生素的污水中分离出了3个抗生素耐药型丛毛单胞菌菌株(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)为了测试其在高浓度抗生素条件下的增殖能力，他们进行了如下实验：①将等量的三种菌株，分别接种到添加了高浓度抗生素和一定量类固醇物质的细菌液体培养基中，测量计算初始培养液中种群密度的相对值，之后不断通入无菌空气，在适宜的条件下进行培养；②接种培养开始后100小时内，每20小时取样一次，每次每种菌株重复3次计数，常利用______法接种进行活菌数的测定，从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为______。在测定菌群密度相对值的同时，每次取样还要测定菌液中固醇类物质的浓度。
③下面的曲线图是根据实验过程中所获得的数据绘制而成。
a.与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，造成菌株Ⅰ种群密度下降的原因有______(填序号)。①种内斗争加剧 ②营养物质积累 ③营养物质消耗 ④代谢废物消耗b.从污水处理的角度分析及研究数据来看，菌株______更适合作为污水中类固醇污染物的处理，理由是___________。
【解析】(1)由于鱼塘废水或附近土壤中类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌，所以从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样。(2)根据选择培养基的作用筛选丛毛单胞菌时，通常以类固醇为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
(3)②在对菌种进行分离与计数时常利用稀释涂布平板法接种进行活菌数的测定；根据题中的操作信息，三种菌株，100小时内每20小时取样一次，共取样5次，每次每种菌株重复3次计数，因此从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为45次。③与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，菌株Ⅰ种群密度大幅下降，推测可能的原因是：随着种群数量的增多及营养物质的消耗，种内斗争加剧，以及有害代谢废物的积累等。根据图甲及图乙中的数据综合分析，在实验时间内，菌株Ⅱ种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强，因此其更适合作为污水中类固醇污染物的处理。
答案：(1)这些区域内类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌(2)类固醇 (调pH、)灭菌(3)稀释涂布平板 45 ①③ Ⅱ 在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强
3.(2020·马鞍山一模)尿素是一种重要的农业氮肥，但是并不能直接被农作物吸收。土壤中含大量微生物，其中就有尿素分解菌。某兴趣小组欲从土壤中分离该类细菌，并进行后续培养研究，设计如下实验：
请回答有关问题：(1)称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是______。(2)该兴趣小组设计了A、B两种培养基(成分见表)： 注：+表示有，-表示无
据表分析，两种培养基的碳源是______；培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化，原因是______。接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察____进行初步鉴定。(3)加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是________。配制好的培养基灭菌方法是______。(4)若用平板划线法接种微生物，在培养基上共划了4个区域，则至少需要______次灼烧接种环。
【解析】(1)微生物培养的关键是无菌操作，称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是防止杂菌污染。 (2)由表可知，两种培养基的碳源是葡萄糖；培养基A和培养基B的区别是有无琼脂，即培养基A为固体培养基，培养基B为液体培养基，分离微生物需要用固体培养基，故培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化。由鉴定分解尿素细菌的原理可知，接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察培养基是否变红进行初步鉴定。
(3)加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是为细菌生长提供营养物质，调节pH。培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。(4)采用平板划线法纯化微生物时，每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后还需灼烧接种环，若划线时在培养基上共划了4个区域，则需要5次灼烧接种环。
答案：(1)防止空气中的杂菌污染(2)葡萄糖 分离微生物需要用固体培养基或液体培养基不能用于分离纯化 培养基是否变红(培养基颜色) (3)为细菌生长提供营养物质，调节pH 高压蒸汽灭菌法 (4)5
4.(2020·丹东模拟)研究发现，牛的瘤胃中含有多种纤维素分解菌，这些纤维素分解菌可用于分解秸秆等废弃物。某科研小组按以下实验流程分离获取了牛瘤胃中的纤维素酶高产菌株。
(1)纤维素酶是由多种酶组成的复合酶，其中能催化纤维二糖水解的是_____。纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的_____进行定量测定。(2)步骤A是______，可以通过此步骤增加______。(3)科研小组的某个同学将瘤胃菌种提取液接种到适宜的培养液中，调节pH及温度至适宜条件，并持续通入无菌空气，结果一段时间后发现培养液中几乎没有菌种，原因是 _______________。
(4)按照修正后的实验方法，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明圈的菌落(如图)。图中透明圈的大小与纤维素酶的______有关；图中降解纤维素能力最强的菌株是______。
(5)现利用稀释涂布平板法测定该目的菌的数量，在同一稀释倍数下4个平板上均接种0.1 mL样品溶液，菌落数分别为156、178、486、191，通过计算得知原样品溶液中每毫升含有目的菌1.75×108个，则稀释倍数是___________。
【解析】(1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种，其中能够将纤维二糖分解为葡萄糖的是葡萄糖苷酶。一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。(2)牛胃取样后，使用选择培养基选择培养，目的是增加纤维素分解菌(或目的菌)的浓度，因此步骤A是选择培养。(3)由于瘤胃中的微生物为厌氧型，不能在有氧环境中生存、繁殖，所以将瘤胃菌种提取液接种到适宜的培养液中，调节pH及温度至适宜条件，并持续通入无菌空气，一段时间后发现培养液中几乎没有菌种。
(4)按照修正后的实验方法，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明圈的菌落(如图)。图中透明圈的大小可以反映纤维素分解菌产生的酶的多少(产量)及酶的活性；图中菌2周围的透明圈最大，降解纤维素能力最强。 (5)用于计数细菌菌落的常用方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克该土壤样品中的菌落数对应的应该是每毫升菌液中的细菌数目，所以每克该土壤样品中的菌落数为(156+178+191)÷3÷0.1×稀释倍数=1.75×108，因此稀释倍数= 105。
答案：(1)葡萄糖苷酶 葡萄糖(2)选择培养 纤维素分解菌的浓度(3)瘤胃中的微生物为厌氧型，不能在有氧环境中生存、繁殖(4)产量和活性 菌2(5)105
【拓展视野】 选择培养基的作用原理(1)在培养基中加入某种化学物质，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在满足基本所需培养成分的基础上加入的。(2)改变培养基中的营养成分，如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件，如将培养基放在高温环境中可以得到耐高温的微生物。
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