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新高考生物二轮复习核心考点梳理与分层练习专题33 微生物的培养与利用（含解析）
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这是一份新高考生物二轮复习核心考点梳理与分层练习专题33 微生物的培养与利用（含解析），共45页。试卷主要包含了微生物的实验室培养，分解纤维素的微生物的分离等内容，欢迎下载使用。
专题33 微生物的培养与利用
考点一、微生物的实验室培养
【要点速记】
1．培养基
（1）概念：人们按照微生物对_________的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）种类：液体培养基和______________培养基，二者的区别为是否添加_____________。
（3）营养成分。
①主要营养物质：_____________、_____________、水和无机盐。
②其他条件：pH、_______________物质和氧气。
2．无菌技术
（1）目的：获得_______________________________。
（2）关键：防止___________________________的入侵。
（3）常用方法：_______________和_______________。
（4）无菌技术的主要方法及适用对象：
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：
（1）计算：依据配方比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。
（2）称量：准确地称取各种成分。
（5）倒平板：待培养基冷却至___________℃左右时，在_____________倒平板。
4．纯化大肠杆菌
（1）菌落：由____________繁殖而来的肉眼可见的_____________群体。
（2）两种常用接种方法的比较：
常用方法
平板划线法
稀释涂布平板法
纯化原理
通过接种环在________________的表面_______________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
将菌液进行一系列的____________，然后将不同稀释度的菌液分别______________到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤
_______________操作
系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具
接种环
_______________
平板示意图
相同点
都能获得单细胞菌落
不同点
平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数
5．菌种的保藏方法
主要方法
临时保藏法
甘油管藏法
保藏对象
频繁使用的菌种
____________的菌种
方法步骤
先接种到试管的_________培养基上培养，然后放入_____________的冰箱中
转入灭菌后的_____中，混匀后放在_________冷冻箱中保存
【重难点突破】
1．培养基的配制原则“三要”
（1）目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
（3）pH要适宜：一般的细菌适合于中性环境生长，放线菌适合于偏碱性环境，而酵母菌和霉菌适合于微酸性环境，配制培养基时需要根据微生物的类群调节pH。
2．消毒和灭菌的比较
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒
接种室、接种箱、超净工作台等
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具等
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具等
高压蒸汽灭菌法
培养基、容器等
3．平板划线操作中灼烧接种环的目的
灼烧时间
灼烧目的
第一次划线前
杀死接种环上原有的微生物，防止外来杂菌污染培养基
第二次及以后每次划线前
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端
最后一次划线后
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
考点二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【要点速记】
1．筛选菌株
（1）寻找目的菌株的方法：根据它对____________的要求，到相应的环境中去寻找。
（2）实验室中微生物的筛选。
①方法：____________有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。
②实例：筛选尿素分解菌时使用以________为唯一氮源的________培养基进行培养。
（3）选择培养基：在微生物学中，允许____________的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基。
2．统计菌落数目
比较项目
间接计数法
（稀释涂布平板法）
直接计数法
（显微镜直接计数法）
原理
样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的___________活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定_______________________或_____________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌株数= _____________
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是____________
不能区分细胞死活
误差
比实际值偏____________
比实际值偏____________
细菌的数目还可以通过_______来测定
3．设置对照和重复
比较项目
对 照
重 复
目的
排除___________对实验结果的影响
排除_________对实验结果的影响
方法
空白对照：确定培养基制作是否合格；条件对照：用________培养基与选择培养基对照，说明选择培养基具有选择作用
同一稀释度涂布至少_________个平板
4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5．分解尿素的细菌的鉴别
（1）方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入___________指示剂培养分解尿素的细菌。
（2）原理：
（3）实验现象及结论：
①培养基变红：该种细菌_______________分解尿素。
②培养基不变红：该种细菌___________分解尿素。
6．微生物的观察：
一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的____________，包括________的________、大小、____________和______________等方面。
【重难点突破】
1．选择培养基的制作方法
2．两种纯化细菌方法的辨析
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
考点三、分解纤维素的微生物的分离
【要点速记】
1．纤维素酶
2．纤维素分解菌的筛选
3．实验流程
【重难点突破】
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
种类
选择培养基
鉴别培养基
制备方法
培养基中加入某些化学物质
培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计
依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计
用途
从众多微生物中“分离”所需的微生物，淘汰不需要的微生物
“鉴别”不同种类的微生物（注：未淘汰其他微生物）
举例
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
2．分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较
分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
（1）选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
（2）鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。
（3）刚果红染色法应用于鉴别培养基。
要点速记答案
考点一、1．（1）营养物质 （2）固体 凝固剂 （3）碳源 氮源 特殊营养 2．（1）纯净的培养物 （2）外来杂菌 （3）灭菌 消毒 （4）a－Ⅲ－⑤、a－Ⅴ－④、a－Ⅵ－③ b－Ⅰ－⑥、b－Ⅱ－①、b－Ⅳ－② 3．（3）称量纸 蛋白胨 琼脂 （4）pH 高压蒸汽 121℃ （5）50 酒精灯火焰附近 4．（1）一个细菌 子细胞 （2）琼脂固体培养基 连续划线 梯度稀释 涂布 平板划线 涂布器 5．长期保藏 固体斜面 4℃ 甘油 －20℃
考点二、1．（1）生存环境 （2）人为提供 尿素 选择 （3）特定种类 抑制或阻止 2．一个 细菌计数板 血细胞计数板 （C÷V）×M 一个菌落 小 大 滤膜法 3．非测试因素 偶然因素 完全 3 4．脲酶 尿素 直接计数法 稀释涂布平板法 系列稀释 计数 5．（1）酚红 （2）2NH3 红色 （3）能 不能 6．菌落特征 菌落 形状 隆起程度 颜色
考点三、1．C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶 纤维二糖 葡萄糖 2．红色复合物 透明圈 刚果红 透明圈 纤维素 3．纤维素 选择培养基 鉴别纤维素分解菌
专题33 微生物的培养与利用（基础）
一、单选题
1．培养下列微生物，培养基中不用添加碳源的是（ ）
A．蓝藻 B．酵母菌 C．醋酸菌 D．毛霉
【答案】A
【解析】蓝藻是原核生物，含藻蓝素、叶绿素，能利用二氧化碳无机碳源进行光合作用合成有机物，是自养型生物，故不需要添加碳源，A正确；酵母菌是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，B错误；醋酸菌是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，C错误；毛霉是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，D错误。
2．细菌喜荤、霉菌喜素的意思是在配制培养基时（ ）
A．要调整培养基的pH B．要考虑不同微生物的代谢特性
C．要调整培养基的渗透压 D．要考虑不同微生物的结构特性
【答案】B
【解析】培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
3．某学生在实践酒酿酵母菌的培养探索时，对部分培养基成分进行了改良，如表。其中主要提供氮源的培养基成分是（ ）
培养基成分
用量（g）
黄豆粉
10
葡萄糖
5
琼脂
15
A．琼脂 B．黄豆粉 C．葡萄糖 D．黄豆粉和葡萄糖
【答案】B
【解析】琼脂是凝固剂，不能提供氮源，A错误；黄豆粉富含蛋白质，能够提供氮源，B正确；葡萄糖只含C、H、O三种元素，不能提供氮源，C错误；黄豆粉能够提供氮源，但葡萄糖不能提供氮源，D错误。
4．在分离和纯化土壤中自生固氮菌的实验中，不合理的操作是（ ）
A．取土表3-5cm以下土层的土壤 B．用无菌水稀释土壤样品
C．使用牛肉膏蛋白胨培养基 D．用接种环进行划线接种
【答案】C
【解析】土表3-5cm以上的土壤比较干燥，自生固氮菌的数量较少，因此取土表3-5cm以下土层的土壤，A正确；用无菌水稀释土壤样品，否则可能造成土壤被杂菌污染，B正确；自生固氮菌可以在缺乏氮源的培养基中生存，牛肉膏蛋白胨培养基含有氮源，用其分离出的微生物既有自生固氮菌也有其他的杂菌，无法纯化自生固氮菌，C错误；接种自生固氮菌时可用接种环进行划线接种，也可用涂布器用稀释涂布平板法接种，D正确。
5．关于微生物的营养，说法正确的是（ ）
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B．凡是碳源都能提供能量
C．除水以外的无机物仅提供无机盐 D．无机氮源也可能提供能量
【答案】D
【解析】对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如牛肉膏，A错误；CO2和N2是无机物，也是某些微生物的碳源和氮源，B错误；有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量，C错误；自然界中一些微生物如硝化细菌，可以以无机氮源合成细胞物质，同时通过氧化外界无机物获得生长所需能量，叫做化能合成作用，D正确。
6．灭菌的标准是（ ）
A．杀死所有的细菌 B．杀死所有的微生物的细胞、芽孢和孢子
C．杀死所有的病原微生物 D．使病原菌不生长
【答案】B
【解析】菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子），B正确。
7．如图为实验室培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列说法正确的是（ ）
A．步骤①中待培养基冷却后才能盖上培养皿盖
B．步骤④中接种环共需5次灼烧处理
C．将接种后的图④平板放入培养箱中培养时无需倒置
D．①②③步骤操作时都需要在酒精灯火焰旁进行
【答案】D
【解析】步骤①将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中应立即该上培养皿盖，A项错误；每次划线前后都要对接种环进行灼烧处理，因此步骤④中接种环共需6次灼烧处理，B项错误；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱培养，防止冷凝水污染培养基，C项错误；培养与纯化大肠杆菌的过程中需要在酒精灯的火焰旁进行，故①②③步骤操作时都需要在酒精灯火焰旁进行，D项正确。
8．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（ ）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
【答案】D
【解析】高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖，B错误；接种环火焰上灼烧后，待冷却后才可以快速挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。
9．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10％酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分别分离出（ ）
A．大肠杆菌 B．霉菌 C．放线菌 D．固氮细菌
【答案】A
【解析】大肠杆菌需要氮源，青霉素能抑制大肠杆菌生长，酚也能抑制大肠杆菌的生长，A符合题意；霉菌是真菌，在培养基中加入青霉素后，青霉素可以抑制细菌和放线菌，但是不抑制真菌，所以加入青霉素的培养基可以选择出霉菌，B不符合题意；培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌，所以可以筛选放线菌，C不符合题意；固氮细菌的氮源是氮气，在培养基中不需要氮源，所以缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，但是固氮细菌可以生长，D不符合题意。
10．微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于这两种接种方法的叙述中，不正确的是（ ）
A．都只能用于固体培养基接种 B．都能用于微生物的计数
C．接种培养后均可获得单菌落 D．接种工具使用后需要灭菌
【答案】B
【解析】将微生物接种到固体培养基中的方法通常为平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板划线法常用来筛选分离微生物，B错误；两种接种方法在培养基中均可形成单个菌落，C正确；为防止污染，接种工具使用后需要灭菌，D正确。
11．甲、乙、丙是三种微生物，下表I、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在I中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）
粉状硫
10g
K2HPO4
4g
FeSO4
0.5g
蔗糖
10g
（NH4）2 SO4
0.4g
H2O
100ml
MgSO4
9.25g
CaCl2
0.5g
I
+
+
+
+
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A．甲、乙、丙都是异养微生物
B．甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物
C．甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物
D．甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物
【答案】D
【解析】根据以上分析已知，乙属于自养微生物，A错误；甲能够在Ⅰ中正常生长繁殖，但是不能在Ⅱ培养基中生长繁殖，说明其为异养微生物，B错误；根据以上分析已知，丙属于异养微生物，C错误；根据以上分析已知，甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物，D正确。
12．细菌培养过程中分别采用高压蒸汽、酒精、火焰灼烧几种不同处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（ ）
A．接种环、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种环、手、高压锅
【答案】C
【解析】接种环应该进行灼烧灭菌，手应该用酒精消毒，培养基应该进行高压蒸汽灭菌，A错误；高压锅是灭菌工具，手应该用酒精消毒，接种环应该进行灼烧灭菌，B错误；培养基应该进行高压蒸汽灭菌，手应该用酒精消毒，接种环应该进行灼烧灭菌，C正确；接种环应该进行灼烧灭菌，手应该用酒精消毒，高压锅是灭菌工具，D错误。
13．下列有关用平板划线法和稀释涂布平板法纯化培养大肠杆菌的叙述，正确的是（ ）
①都需要用固体培养基 ②都需要使用接种针进行接种
③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用菌落数来计数活菌
A．①② B．①③ C．②④ D．③④
【答案】B
【解析】平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落，所以都需要用固体培养基，①正确；稀释涂布平板法不需要使用接种针进行接种，②错误；为防止杂菌污染，操作时都需要在火焰旁进行接种，③正确；平板划线法不能用于计数活菌，只能用于分离菌种；稀释涂布平板法可以用来计数活菌，④错误。
14．某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。 下列叙述正确的是（ ）
A．培养基分装到培养皿后进行灭菌 B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养 D．培养过程中每隔一周观察一次
【答案】B
【解析】可以直接在锥形瓶灭菌，然后再分装到灭菌过的培养皿中，如果分装到培养皿中再灭菌，不便移动操作；A错误；接种环暴露在空气中一段时间后就需再进行灼勺灭菌；B正确；微生物培养一般不需要光照条件；C错误；根据不同的微生物，间隔观察时间不同，如也可能每天定时观察。D错误。
15．下图是划线分离法接种微生物的示意图，下列叙述错误的是（ ）
A．该接种过程一般需灼烧接种环5次
B．划线结束可看到划线末端出现不连续单菌落
C．若培养的是尿素分解菌，可加入酚红指示剂
D．该接种方法不能准确计数培养液中微生物数量
【答案】B
【解析】为了防止杂菌污染，每一次的划线之前和划线操作结束后都需要将接种环灼烧灭菌，图示中共有4个划线区域，因此该接种过程一般需灼烧接种环5次，A正确；划线结束后，将培养皿倒置放在一定温度的恒温培养箱中培养一定时间后，可看到划线末端出现不连续单菌落，B错误；若培养的是尿素分解菌，因该菌合成的脲酶可将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，所以可加入酚红指示剂来予以鉴定，C正确；该接种方法（划线分离法）不易分离出单个菌落，不能准确计数培养液中微生物数量，D正确。
16．关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中错误的是（ ）
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板
D．待平板冷却凝固约5~10 min后将平板倒过来放置
【答案】A
【解析】制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，A错误；将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热，B正确；待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，C正确；待平板冷却凝固约5〜l0min后将平板倒过来放置，以防止水蒸气凝集滴入培养基，D正确。
17．图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是（ ）
A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌
B．划线操作必须在火焰上进行
C．最可能得到所需菌落的区域是1
D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
【答案】D
【解析】操作前要将接种环放在火焰外焰中灼烧灭菌，A错误；划线操作必须在火焰附近进行，B错误；区域5是划线末端菌液最少处，最有可能得到所需的单菌落，C错误；在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌，D正确。
18．平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是（ ）
A．接种时再拿起来方便 B．在皿底上标记日期等方便
C．正着放置容易破碎 D．防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
【答案】D
【解析】微生物实验室培养的关键在于防止杂菌污染，平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，故选D。
19．下列有关分解纤维素的微生物的分离的叙述，说法错误的是（ ）
A．纤维素酶中的C1酶和CX酶可以将纤维素分解为纤维二糖
B．分离纤维素分解菌时，可在倒平板时加入刚果红染色，然后接种分解菌
C．纤维素酶的发酵方法有液体发酵法和固体发酵法
D．要增加纤维素分解菌的浓度，应使用固体培养基进行选择培养
【答案】D
【解析】纤维素酶中的C1酶和CX酶可以将纤维素分解为纤维二糖，A正确；分离纤维素分解菌时，可在倒平板时加入刚果红染色，然后接种分解菌，B正确；纤维素酶的发酵方法有液体发酵法和固体发酵法，C正确；要增加纤维素分解菌的浓度，应使用以纤维素为唯一碳源的液体培养基进行选择培养，D错误。
20．某生物兴趣小组欲配制培养基从土壤中选择尿素分解菌。下列相关叙述正确的是（ ）
A．配制以尿素为唯一氮源的液体培养基可用于选择和观察尿素分解菌
B．为获取102的稀释液可将90 mL无菌水加入10 g土壤样品中
C．实验中若需要统计尿素分解菌的菌落数目，接种时只能用平板划线法
D．实验中设置对照，同时培养一个空白培养基可检验培养基灭菌是否彻底
【答案】D
【解析】选择和观察尿素分解菌时需要配制以尿素为唯一氮源的固体培养基，A错误；10 g土壤样品加入90 mL无菌水中，振荡摇匀后可获得10倍的稀释液，B错误；实验中若需要统计尿素分解菌的菌落数目，接种时只能用稀释涂布平板法，C错误；实验中设置对照，同时培养一个空白培养基，可通过空白培养基上是否有菌落来判断培养基灭菌是否彻底，D正确。
21．某同学依据下图操作步骤，从土壤中分离以尿素为氮源的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是（ ）
A．尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂
B．以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌
C．利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率
D．两种步骤获得的菌落比值相等（甲1/甲2＝乙1/乙2）
【答案】C
【解析】尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素用过滤灭菌，B错误；利用液体培养基进行培养的过程中，通过振荡可以提高营养成分的利用率，C正确；两种步骤获得的菌落比值关系为（甲1/甲2＞乙1/乙2），因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变多，D错误。
22．下列检测某熟制食品中大肠杆菌是否超标的实验操作，不合理的是（ ）
A．待检测食品需要经过灭菌操作后取样检测
B．应设置未接种的培养基，作为实验的对照
C．用稀释涂布平板法接种计数大肠杆菌的活菌数
D．接种后将培养皿倒置并在适宜温度下培养
【答案】A
【解析】待检测食品灭菌后会将大肠杆菌杀死，则不能检测大肠杆菌是否超标，A错误；应设置未接种的培养基，作为实验的对照，B正确；用稀释涂布平板法接种计数大肠杆菌的活菌数，C正确；接种后应该将培养皿倒置，并在适宜温度下培养，D正确。
二、综合题
23．回答下列有关微生物培养和利用的有关问题：
（1）按照培养基的成分来分，培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。
①在酿制葡萄酒时，葡萄汁就相当于是酵母菌发酵的天然培养基。在_____________的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应而受到抑制。
②虽然各种培养基的具体配方不同但一般都含碳源、氮源、无机盐和水。培养基中能同时提供碳源和氮源的成分是_______________（“蛋白胨”“葡萄糖”“NaNO3”）。
（2）按照培养基用途来分，培养基按其特殊用途可分为富集培养基、选择性培养基和鉴别培养基。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作________________。在选择培养基中添加一些特殊的物质，则可配制成鉴别培养基。如在尿素为唯一氮源的培养基中加入_______________，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，则可初步鉴定为该种细菌能够分解尿素；在纤维素为唯一碳源的培养基中加入______________，当纤维素被分解后，其与纤维素形成的红色复合物就无法形成。
（3）微生物培养中，稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为______________________________________。
【答案】（1）缺氧、呈酸性 蛋白胨
（2）选择培养基 酚红指示剂 刚果红
（3）当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
【解析】（1）①在酿制葡萄酒时，葡萄汁就相当于是酵母菌发酵的天然培养基，酵母菌为兼性厌氧型微生物，在氧气充足条件下，能进行有氧呼吸并大量繁殖，在无氧条件下能进行酒精发酵，在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应而受到抑制。
②虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含碳源、氮源、无机盐和水。培养基中能同时提供碳源和氮源的成分是蛋白胨。
（2）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。在选择培养基中添加一些特殊的物质，则可配制成鉴别培养基。如在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，则可初步鉴定该种细菌能够分解尿素，产生NH3；在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，由于刚果红能和纤维素结合形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）微生物培养中，稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目。然而当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
24．尿素是一种重要的农业氮肥，但是并不能直接被农作物吸收。土壤中含大量微生物，其中就有尿素分解菌。某兴趣小组欲从土壤中分离该类细菌，并进行后续培养研究，设计了如下实验：
请回答有关问题：
（1）称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是_____________。
（2）该兴趣小组设计了A、B两种培养基（成分见下表）：
葡萄糖
无机盐
尿素
琼脂
酚红溶液
水
培养基A
＋
＋
＋
＋
＋
＋
培养基B
＋
＋
＋
－
＋
＋
注：＋表示有，－表示无
据表分析，两种培养基的碳源是________________；培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化，原因是________________________。接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察_______________进行初步鉴定。
（3）加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是________________。配置好的培养基灭菌方法是_______________________。
（4）若用平板划线法接种微生物，在培养基上共画了4个区域，则至少需要__________次灼烧接种环。
【答案】（1）防止空气中的杂菌污染
（2）葡萄糖 分离微生物需要用固体培养基或者液体培养基不能用于分离纯化 培养基是否变红（培养基颜色）
（3）为细菌生长提供营养物质，调节pH值 高压蒸汽灭菌法
（4）5次
【解析】（1）微生物培养的关键是无菌操作，称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是防止杂菌污染。
（2）由表可知，两种培养基的碳源是葡萄糖；培养基A和培养基B的区别是有无琼脂，即培养基A为固体培养基，培养基B为液体培养基，分离微生物需要用固体培养基，故培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化。由鉴定分解尿素细菌的原理可知，接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察培养基是否变红进行初步鉴定。
（3）加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是为细菌生长提供营养物质，调节pH值。培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。
（4）采用平板划线法纯化微生物时，每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后还需灼烧接种环，若划线时在培养基上共画了4个区域，则需要5次灼烧接种环。
25．牛奶消毒不过关容易携带细菌。根据国家标准（GB19645—2010）规定，每毫升合格的牛奶细菌总数不能超过50000个。某兴趣小组利用恒温水浴锅对新鲜牛奶进行消毒然后检测消毒的效果，如下图所示。
（1）图中步骤①对牛奶的消毒的方法是_____________，一般采用__________对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，蛋白胨的作用有________________________________（写两点）。
（2）步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成___________。步骤③的接种方法是_______________，这种方法可以用来统计样品中活菌的数目，其原理是___________________________________________________________。
（3）兴趣小组通过步骤①～③接种了3个平板和1个未接种的平板放入恒温培养箱，在适宜的温度条件下培养48h，然后统计出4个平板上的菌落数分别是57、53、55和9。根据这样的实验结果________（填“能”或“不能”）判断该兴趣小组消毒后的牛奶细菌超标，原因是_________________________________。
（4）如果要检测牛奶中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入____________（填物质），观察是否出现黑色（或蓝黑色）的菌落。
【答案】（1）巴氏消毒 高压蒸汽灭菌 提供碳源、氮源等
（2）单个菌落 稀释涂布平板法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌
（3）不能 因为未接种的培养基上有菌落出现，说明培养基灭菌不彻底，则其它培养基上的菌落数不能表示牛奶中细菌数量
（4）伊红美蓝
【解析】（1）图中步骤①对牛奶的消毒方法是巴氏消毒，既可以杀灭牛奶中的微生物，又可以使牛奶中的营养成分不会被破坏。对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法，蛋白胨含多种有机物，能为微生物提供碳源、氮源、维生素等。
（2）步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成单个菌落。步骤③的接种方法是稀释涂布平板法，这种方法可以用来统计样品中活菌的数目，其原理是样品稀释度足够高时，稀释液中的一个活菌可在平板上长出一个单菌落，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（3）由于未接种的平板上也有菌落，说明培养基灭菌不合格，则其它培养基上的菌落数不能表示牛奶中细菌数量，故不能由上述平板上菌落数计算消毒后的牛奶细菌是否超标。
（4）伊红美蓝可使大肠杆菌的菌落呈现黑色，所以要检测牛奶中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入伊红美蓝，观察是否出现黑色（或蓝黑色）的菌落。
专题33 微生物的培养与利用（提高）
一、单选题
1．为了筛选出能产生脲酶的微生物，应当从下列哪一种环境中选择（ ）
A．施用尿素较多的农田 B．施用氨肥较多的农田
C．施用磷肥较多的农田 D．落叶较多的地方
【答案】A
【解析】脲酶可以将尿素分解为二氧化碳和氨气，其底物为尿素，因此筛选能产生脲酶的微生物，应当从尿素较多的农田中获得， BCD错误，A正确。
2．下列关于无菌操作的叙述，错误的是（ ）
A．煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
B．加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
C．利用组织培养技术繁殖脱毒苗时，需要对植物的外植体进行消毒
D．接种时灼烧接种环要冷却后再对菌种划线
【答案】B
【解析】100℃煮沸5~6min可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，A正确；指示剂和染料可能混有微生物，故加入培养基前需灭菌，B错误；利用组织培养技术繁殖脱毒苗时，为防止细菌污染，应对外植体进行消毒，C正确；接种时灼烧接种环要冷却后再对菌种划线，以免接种环温度太高，杀死菌种，D正确。
3．下列有关微生物培养的叙述，正确的是（ ）
A．培养过微生物的培养基经灭菌后仍可用于培养微生物
B．涂布接种时，要待涂布器上酒精燃尽后冷却再使用
C．对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿盖标记便于观察
D．长期保存菌种时，可以采用甘油管藏的方法，放在 4℃冰箱中保存
【答案】B
【解析】培养过微生物的培养基应该经灭菌后扔掉，A错误；涂布接种时，应该将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s，B正确；对培养皿进行标记时，应该在皿底进行标记，C错误；长期保存菌种时，可以采用甘油管藏法，放入-20度的冷冻箱中保存，D错误。
4．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是（ ）
A．链霉素能阻止结核菌的生长
B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
【答案】D
【解析】抗生素是真菌（另外还有放线菌）产生的可杀死某些致病菌的物质，可以用来治疗相应的疾病。如图所示，实验结果表明，链霉菌产生的链霉素是一种抗生素类物质，它可以抑制某些细菌的繁殖。分析实验结果可以看出：链霉素对结核杆菌的抑制作用最强，对霍乱菌的抑制作用较弱，对伤寒菌几乎无抑制作用，ABC正确，D错误。
5．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物的描述中，不正确的是（ ）
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮元素 B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质 D．水是该微生物的营养物质之一
【答案】B
【解析】氮源物质为该微生物提供必要的氮素，A正确；该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质，B错误；无机盐是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；水是该微生物的营养物质之一，D正确。
6．在做分离“分解尿素的细菌”实验时，A同学从对应10-6培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述不正确的是（ ）
A．A同学出现这种结果的原因可能是土样不同
B．可以将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
C．让其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一样，则可证明A同学无误
D．B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，而C选项的没有
【答案】D
【解析】A同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作中污染造成的，A正确；A同学的实验结果可能是培养基污染造成的，可以将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，B正确；如果是A同学实验操作过程中污染造成的，让其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一样，则可证明A同学无误，C正确；B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则，D错误。
7．为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】B
【解析】倒平板后无需晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
8．产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是（ ）
A．使用平板划线法可以在⑥上获得单个菌落
B．如果要测定②中的活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
D．微生物培养前，需对培养基和培养皿进行消毒处理
【答案】D
【解析】平板划线法可分离微生物，可获得单个菌落，A正确；利用稀释涂布平板法可对微生物进行计数，B正确；图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源，以扩大降解苯酚的微生物的浓度，C正确；微生物培养前，需对培养基和培养器皿进行灭菌处理，D错误。
9．下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（ ）
A．平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
B．用富含尿素的培养基富集培养尿素分解菌
C．稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D．用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
【答案】A
【解析】平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散，但无法计数，A错误；用富含尿素的培养基富集培养尿素分解菌，B正确；稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散，C正确；用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大，因为有些死菌也被计入其中，D正确。
10．茶叶中含多种物质，其中茶多酚具有杀菌消炎作用。为研究茶多酚的抑菌效果，研究人员进行了相关实验。下表所示为在不同pH、茶多酚浓度为40g/L时的实验结果。
菌种
抑菌圈直径（mm）
pH=4
pH=5
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
沙门氏菌
14．0
13．7
13．8
14．3
15．5
14．6
12．5
蜡状芽孢杆菌
16．0
15．5
14．7
15．7
17．4
15．6
13．5
大肠杆菌
11．8
12．9
12．7
13．8
15．0
14．4
12．8
结合表中数据分析，可得到的结论是（ ）
A．不同pH条件下，茶多酚对同一种细菌的抑制效果不同
B．相同pH条件下，茶多酚对三种细菌的抑制效果相同
C．茶多酚对三种细菌的抑制效果均最强时的最适pH是7
D．浓度为40g/L的茶多酚是抑制三种菌繁殖的最适浓度
【答案】A
【解析】不同pH条件下，茶多酚对同一种细菌的抑制效果不同，A正确；任选一个pH值对比即可发现茶多酚对不同细菌产生的抑菌圈直径是不同的，所以相同pH条件下，茶多酚对三种细菌的抑制效果不同，B错误；找出每一行细菌抑菌圈最大值对应的pH值，可知茶多酚对三种细菌的抑制效果均最强时的最适pH是8，C错误；本题中未比较其他浓度的茶多酚抑菌效果，因此不能判断40g/L是否为抑制三种菌繁殖的最适浓度，D错误。
11．下列关于微生物培养和分离的说法中，正确的是（ ）
A．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，立即出现有透明圈的菌落
B．筛选纤维素分解菌的实验流程中不可省略选择培养这一步
C．菌落的大小、颜色、有无荚膜、隆起程度等特征都可作为菌种肉眼鉴定的依据
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
【答案】D
【解析】先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，此种方法需用氯化钠洗去浮色，再观察出现有透明圈的菌落，A错误；选择培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌少，B错误；菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据，但是有无荚膜通过肉眼无法观察，C错误；在只含有尿素作为氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌，D正确。
12．秸秆还田可增加土壤肥力，缓解环境污染。为分离分解纤维素的微生物菌种，实现废物的资源化利用，研究人员设计了“土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌株”的实验流程。下列叙述错误的是（ ）
A．配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之后调节pH
B．选择培养时，应使用纤维素为唯一碳源的培养基
C．进行梯度稀释时，应在酒精灯火焰旁完成各种操作
D．挑选菌株后，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃
【答案】A
【解析】配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之前调节pH，避免灭菌之后调pH造成杂菌污染，A错误；选择培养时，为分离分解纤维素的微生物菌种，应使用纤维素为唯一碳源的培养基，B正确；进行梯度稀释时，为了无菌操作，应在酒精灯火焰旁完成各种操作，C正确；挑选菌株后，为了防止造成污染，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃，D正确。
13．尿素分解菌可将土壤中的尿素分解成CO2和NH3供植物利用。下列关于土壤中尿素分解菌的分离和计数的叙述，错误的是（ ）
A．尿素分解菌能分解尿素是因为能合成脲酶
B．培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性
C．用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌
D．若用稀释涂布平板法计数，统计的细菌数往往比活菌的实际数目多
【答案】D
【解析】尿素分解菌可以合成脲酶，将尿素分解成CO2和NH3，A正确；培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性，B正确；用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌，C正确；由于两个或多个细菌可能形成一个菌落，所以用稀释涂布平板法接种，统计的数目比实际的数目少，D错误。
14．黑茶是利用微生物的酶促进茶多酚氧化的发酵茶。研究人员对黑茶中的微生物进行了分离和鉴定，过程如图所示。下列相关叙述不正确的是（ ）
A．向样品中加入无菌水制成样品悬液
B．可根据菌落特征对菌种进行初步鉴定
C．涂布平板上长出的菌落可通过划线法进一步纯化
D．斜面培养基含大量营养物质，常温下可长期保存
【答案】D
【解析】制备样品悬液时应向黑茶样品中加入无菌水，A正确；可以根据菌落的形状、大小等菌落特征对菌种进行初步的鉴定或分类，B正确；涂布平板上长出的菌落，可通过平板划线法进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
15．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法中，错误的是（ ）
A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C．如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
【答案】D
【解析】土壤是微生物的天然培养基，土壤中各类微生物的数量不同，获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离，A正确；土壤中细菌总量高于定土壤中能分解尿素的细菌的数量，所以选用的稀释范围不同，B正确；稀释涂布平板法进行计数时，得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，C正确；选择培养基的菌落数目明显小于牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落，D错误。
二、综合题
16．研究人员欲从土壤中分离出高效分解尿素的尿素小球菌，进行了一系列操作。回答下列相关问题：
（1）为了获得尿素小球菌，可在含尿素较多的土壤中取样，并应选用以__________为唯一氮源的培养基进行选择培养。除氮源外，培养液还应含有__________等营养物质。
（2）培养基中的琼脂属于多糖类物质，但是它并不能为尿素小球菌提供碳源，原因是____________________________________________________________________________。
（3）对采集的土壤样品一般先用____________进行稀释，再进行平板培养，从中选出菌落数在____________间的平板计数。该方法计数的结果往往偏小，原因是__________________。
（4）对分离得到的尿素小球菌作进一步鉴定时，可在上述培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红的原因是______________________，再结合菌落的特征等进行确定。
（5）将获得的3种待选微生物甲、乙、丙分别接种在相同的选择培养基中培养，其他营养物质充裕、条件适宜，观测从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为23 h、17 h、29 h，则应选择微生物__________作为菌种进行后续培养。
【答案】（1）尿素 碳源、水、无机盐
（2）尿素小球菌细胞中缺乏分解琼脂的酶
（3）无菌水 30~300 当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数
（4）尿素小球菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强 乙
【解析】（1）为了获得尿素小球菌，可在含尿素较多的土壤中取样，并应选用以尿素为唯一氮源的培养基进行选择培养。培养基营养组成一般都含有氮源、碳源、水和无机盐等营养物质。
（2）由于尿素小球菌细胞中缺乏分解琼脂的酶，所以培养基中的琼脂虽属于多糖类物质，但是它并不能为尿素小球菌提供碳源。
（3）对采集的土壤样品一般先用无菌水进行稀释，再进行平板培养，从中选出菌落数在30~300间的平板计数。该方法计数的结果往往偏小，原因是当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数。
（4）对分离得到的尿素小球菌作进一步鉴定时，可在上述培养基中加入酚红指示剂，由于尿素小球菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，进而使酚红指示剂变红。
（5）由题意可知，微生物乙在选择培养基中从实验开始到停止生长所用的时间较微生物甲、丙短，说明微生物乙分解尿素的能力比甲、丙更强，所以应选择微生物乙作为菌种进行后续培养。
17．某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用_________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_________________。甲、乙培养基均属于________________培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释__________倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是__________________________________________（答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤________________。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即____________________。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
（2）104
（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数
（5）水、碳源、氮源和无机盐
【解析】（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。
（2）若要在每个平板上涂布100μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1000×100÷200=1×104倍。
（3）当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。
（5）甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
18．研究发现一些嗜冷细菌产生的蛋白酶可使乳蛋白分解，导致牛奶变质。为了筛选检测变质牛奶中的嗜冷细菌，某研学小组做了如图所示实验。（注：培养皿旁的数字代表菌落数目），请回答下列问题：
（1）牛奶饮用前要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，与煮沸消毒相比，巴氏消毒的牛奶在常温（约28℃）下保存时间较短，原因是_________，导致牛奶中营养成分被分解而变质。
（2）若要筛选嗜冷细菌，应将牛奶样品稀释液接种在以_________为唯一氮源的固体培养基上，并且在______的环境条件下培养，以利于嗜冷细菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。
（3）据图分析，研学小组采用的是________________法分离和计数嗜冷细菌。
（4）用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？_________（填“需要”或“不需要”），其原因是_____________________________________________。
（5）按照菌落计数的要求，据图可得出1ml牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为__________个，与用血球计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较_______________。
【答案】（1）（巴氏消毒的）牛奶中没有被杀死的微生物（或细菌）在适宜温度（或常温）下大量繁殖
（2）乳蛋白 低温（或较低温度）
（3）稀释涂布平板
（4）需要 需要证明（或判断）培养基是否被杂菌污染（培养基灭菌是否合格）
（5）3.9×105 少
【解析】（1）由于巴氏消毒的温度为75~80℃之间，有些微生物在此温度下没有被杀死，故在适宜温度（或常温）下，（巴氏消毒的）牛奶中没有被杀死的微生物（或细菌）会大量繁殖，导致牛奶中营养成分被分解而变质。所以巴氏消毒的牛奶在常温（约28℃）下保存时间较短。
（2）由于嗜冷细菌产生的蛋白酶可使乳蛋白分解，故要筛选嗜冷细菌，应将牛奶样品稀释液接种在以乳蛋白为唯一氮源的固体培养基上，并且在低温的环境条件下培养，以利于嗜冷细菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。
（3）根据图示中将牛奶样品稀释后涂在培养基上进行菌落计数，可知研学小组采用的是稀释涂布平板法分离和计数嗜冷细菌。
（4）由于不知道制备的培养基是否被污染，故需要设置不接种微生物的培养基进行对照，以证明（或判断）培养基是否被杂菌污染（培养基灭菌是否合格）。
（5）菌体计数时应选择菌落数在30~300之间的稀释倍数进行计数，由图中菌落数量可知，应选择稀释103的进行计数，故1ml牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为（36+39+42）÷3÷0.1×103=3.9×105个。该种方法计数时，计数的是活菌的数量，且当两个或多个菌体连在一起生长时，平板上观察的只是一个菌落，故与用血球计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较小。
19．多环芳烃菲在染料、杀虫剂等生产过程中被广泛使用，是土壤、河水中常见的污染物之一。下图表示科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解多环芳烃菲的菌株Q的主要步骤。请回答：
（1）步骤①→③的培养过程中，需将锥形瓶放在摇床上振荡，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能__________________________________。
（2）步骤④用平板划线法纯化菌株Q过程中，在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是_________________________________________，同时需要相同条件下培养不接种的培养基平板做对照，采用固体平板培养基培养细菌时要倒置培养，其目的是______________________________。
（3）接种环通过灼烧灭菌，完成步骤④中划线操作，共需灼烧接种环________次。
（4）为了获得分解多环芳烃菲能力更强的菌株，研究人员又对菌种Q进行了诱变处理，得到突变株K。为了进一步鉴定菌株K并比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力，设计了下列实验，请补全实验步骤：
①取9只锥形瓶均分成三组，编号A、B、C
②向A、B、C三组锥形瓶中加入_______________________________________的培养液。
③向A、B、C三组培养液中分别加入___________________________________________。
④28℃恒温培养3天后，测定_________________________________________________。
【答案】（1）增加培养液中的溶氧量（或增加培养液中的含氧量）
（2）线条末端细菌的数目比线条起始处要少（或能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落） 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基（或避免培养基中水分的过快挥发）
（3）6
（4）等量的以多环芳烃菲为唯一碳源 等量的无菌水、菌株Q菌液和突变株K菌液 锥形瓶中多环芳烃菲的降解率
【解析】（1）步骤①→③的培养过程中，需将锥形瓶放在摇床上振荡，目的有两个，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能增加培养液中的溶氧量。
（2）步骤④用平板划线法纯化菌株Q过程中，由于线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线．采用固体平板培养细菌时要倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
（3）接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次。
（4）本实验的目的是比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力。实验设计需要遵循对照原则，对照组需加入等量无菌水；还需遵循单一变量原则，单一变量是菌种类比不同，即菌株Q菌液和突变株K菌液，所以实验设计如下：
①取9只锥形瓶均分成三组，编号A、B、C。
②向9支锥形瓶中分别加入等量以多环芳烃菲为唯一碳源的培养液。
③向A、B、C三组培养液中分别加入等量的无菌水、菌株Q菌液和突变株K菌液。
④28℃恒温培养3天后，测定锥形瓶中多环芳烃菲的降解率。
专题33 微生物的培养与利用（挑战）
一、单选题
1．下列有关微生物的培养和分离的叙述，正确的是（ ）
A．灼烧接种环后，为避免其他杂菌的干扰，应立即伸入菌液取菌种
B．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
C．在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的相同
D．若对大肠杆菌进行计数，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
【答案】B
【解析】接种环必须冷却后，才可以伸入菌液中蘸取一环液，否则会烧伤或烧死微生物，A错误；可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，若空白培养基上有菌种出现，则证明培养基被污染，B正确；在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的不相同，第一次灼烧接种环的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养基，而每次划线前灼烧接种环的目的杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C错误；由于在稀释涂布平板法中，可能会发生多个微生物形成一个菌落的情况，因此涂布平板法统计的大肠杆菌数目会比实际值偏小，D错误。
2．原油（黑褐色黏稠的油状液体）泄漏造成的污染很难清除，我们可以从受原油污染的土壤或海水中筛选出能高效降解原油的菌株。下列有关叙述错误的是（ ）
A．配制选择培养基时需提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制其他微生物生长
B．在供氧充足的条件下培养、分离目的菌株可避免无氧呼吸产物造成的二次污染
C．接种前对菌种进行稀释的目的是使粘在一起的菌体分散开，便于菌株的分离
D．若三个平板上菌落数分别为276、159、32，则平均菌落数约为156
【答案】D
【解析】对微生物的筛选，应人为提供有利于目的菌株生长的条件如营养、温度、PH值等，同时抑制或阻止其他微生物的生长，A正确；微生物在厌氧条件下不能将有机物彻底氧化分解，产生的不彻底氧化产物会导致土壤受到二次污染，B正确；稀释的目的是使粘在一起的菌体分散开，将菌体分散成单个细胞，便于后面在平板上获得单个菌落，C正确；由于三个数值差别太大，可信度差，D错误。
3．圆褐固氮菌具有较强的固氮能力（将大气中的N2固定成NH3），并且能够分泌植物生长素，促进植株生长和果实发育。某研究小组从土壤中分离固氮菌并进行计数，然后制成菌肥施入土壤中以增加土壤肥力，提高农作物的产量。下列有关说法正确的是（ ）
A．圆褐固氮菌固定的氮能直接被植物吸收利用
B．可用酚红对选择培养的圆褐固氮菌进行鉴定
C．筛选圆褐固氮菌的培养基中要加入有机氮源
D．可通过平板划线法对所培养的菌落进行计数
【答案】B
【解析】生物固氮生成的NH3经过土壤中硝化细菌的作用，最终转化成硝酸盐，硝酸盐可以被植物吸收利用，A错误；酚红指示剂在pH升高后将变红，而圆褐固氮菌固氮产生的氨使得pH升高，因此可用酚红对选择培养的圆褐固氮菌进行鉴定，B正确；圆褐固氮菌具有固氮能力，因此筛选圆褐固氮菌的培养基中不要加入有机氮源，C错误；平板划线法只能用于菌种的分离，不能用于菌种的计数，D错误。
4．将从种植烟草的土壤里分离得到的尼古丁（C10H14N2）降解菌株SC接种到尼古丁培养基中，30℃摇床培养并定时取样，测定并计算发酵液中的尼古丁浓度和菌体浓度，得到的结果如图所示。下列分析不正确的是（ ）
A．分离SC时可用稀释涂布平板法或划线法
B．培养36h时SC的数量为该种群的环境容纳量
C．影响SC种群密度变化的主要因素是O2浓度和pH
D．发酵液中的尼古丁为SC提供碳源和氮源
【答案】C
【解析】平板划线法和稀释涂布平板法均可分离和提纯细菌，A项正确；培养36h时，SC的数量达到最大值，为该种群的环境容纳量，B项正确；根据题意可知，尼古丁是SC的主要营养物质，为SC提供碳源和氮源，再结合曲线图可推知，影响SC种群密度变化的主要因素是培养基中尼古丁的含量，C项错误，D项正确。
5．生物燃料是指以纤维素材料为原料生产的燃料乙醇和生物柴油，筛选出能高效分解纤维素的纤维素分解菌是制造生物燃料的重要前提。下列说法正确的是（ ）
A．能够分解纤维素的酶是一种复合酶，其中葡萄糖苷酶能把纤维素分解为纤维二糖
B．在筛选纤维素分解菌的过程中，刚果红染色法能通过颜色反应直接筛选微生物
C．倒平板时加入刚果红染色，优点是显示的颜色反应基本上就是纤维素分解菌的作用
D．用平板划线法对纤维素分解菌进行计数时，应选菌落数在30-300之间的平板计数
【答案】B
【解析】由分析可知，纤维素酶是一种复合酶，至少含有三种组分，即C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶，其中C1酶、Cx酶能把纤维素分解为纤维二糖，A错误；在筛选纤维素分解菌的过程中，发明了刚果红染色法，刚果红染色法能通过颜色反应直接筛选微生物，B正确；由分析可知，倒平板时加入刚果红染色是第二种方法，其优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，而显示的颜色反应基本上就是纤维素分解菌的作用是方法一的典型优点，C错误；用稀释涂布平板法对纤维素分解菌进行计数时，应选菌落数在30-300之间的平板计数，D错误。
6．某同学检测泡菜滤液中的亚硝酸盐含量，并分离纯化其中的乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而 不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜滤液显色的深浅与其中亚硝酸盐的含量呈正相关
B．培养适宜时间后，应挑选出具有透明圈的菌落
C．若要调节培养基的 pH，应该在灭菌之前进行
D．挑选出来的菌落可直接进行涂布分离
【答案】D
【解析】在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料．将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测对比，可以大致估算出亚硝酸盐的含量，所以泡菜滤液显色的深浅与其中亚硝酸盐的含量呈正相关，A正确；由于乳酸菌产生的乳酸将培养基的碳酸钙分解，所以会出现透明圈，因此培养适宜时间后，应挑选出具有透明圈的菌落，B正确；培养基的配制时需要先调节pH，在进行灭菌，避免杂菌的污染，C正确；挑选出来的菌落要先进行稀释在进行涂布，D错误。
7．勤洗手是预防病毒感染的有效措施。某公司在防控新型冠状病毒（2019-nCOV）期间推出一款新型免洗洗手凝胶。为衡量该凝胶的清洗效果，研究人员检测了凝胶洗手前后，手部细菌的含量。凝胶洗手前的检测流程见下图。下列叙述正确的是（ ）
A．统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是平板划线法
B．除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养
C．培养基上的一个菌落只可能来源于样品稀释液中的一个活菌
D．初步判断培养基上菌种的类型，需要用显微镜观察菌体的形状
【答案】B
【解析】平板划线无法得知稀释倍数，不能用于活菌计数，故统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是稀释涂布平板法，A错误；除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养，验证培养基是否被杂菌污染，B正确；由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落，故培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个、甚至几个活菌，C错误；由于菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌体的形态特征，D错误。
8．将同一土壤样本经灭菌和未灭菌处理后．分别放在两个培养皿中，在土壤表面分别放3张废纸（主要成分是纤维素）。然后将两个培养皿放在有较高湿度的培养室中，4~6周后观察两个培养皿的变化情况（如下图）。下列相关叙述错误的是（ ）
A．土壤微生物能够将废纸中的有机物分解成无机物
B．将培养皿和土壤灭菌的方法可以是高压蒸汽灭菌
C．若土壤湿度不够，可加入些清水以控制无关变量
D．若某酵母菌不能利用废纸，可能是由于缺乏相应分解酶系
【答案】C
【解析】废纸的主要成分是纤维素，土壤中分解纤维素的微生物可以利用废纸中的纤维素获取物质和能量，A正确；培养皿和土壤既可以采用干热灭菌，又可以采用高压蒸汽灭菌，B正确；若土壤湿度不够，可加入些无菌水，以控制湿度对实验结果的影响，C错误；某酵母菌不能利用废纸，可能的原因是缺乏相应分解酶系（即缺乏纤维素酶和半纤维素酶），D正确。
9．下列对四种微生物相关的叙述，错误的是（ ）
A．CO2和NH3分别是硝化细菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自NH3的氧化
B．CO2和硝酸盐分别是褐藻的碳源和氮源，该生物所需的能源来自太阳能
C．糖类和N2是乳酸菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自乳酸的氧化分解
D．葡萄糖既是酵母菌的碳源也是其能源，但CO2一定不是酵母菌的碳源
【答案】C
【解析】硝化细菌是化能自养需氧型微生物，CO2和NH3分别是硝化细菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自NH3的氧化，A项正确；褐藻能进行光合作用，CO2和硝酸盐分别是褐藻的碳源和氮源，该生物所需的能源来自太阳能，B项正确；乳酸菌是异养厌氧型微生物，乳酸菌不能固氮，因此N2不是其氮源，乳酸是乳酸菌的代谢产物，乳酸菌的碳源为葡萄糖,氮源为无机盐，该生物所需的能源来自糖类的氧化分解，C项错误；酵母菌是异养生物，葡萄糖既是酵母菌的碳源也是其能源，酵母菌不能直接利用CO2，D项正确。
10．筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C（mm）
透明圈直径：H（mm）
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是（ ）
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【答案】C
【解析】培养基一般含有碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等成分，A正确；筛选淀粉分解菌时，需要对菌液进行一系列的梯度稀释，再将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基上进行培养，B正确；由题意可知，以上两种菌均会产生透明圈，说明两种菌均可以产生淀粉酶并分泌到细胞外分解淀粉，C错误；淀粉分解菌的H/C越大，说明其产生的淀粉酶分解的淀粉相对越多，可说明该淀粉分解菌分解淀粉的能力越强，D正确。
11．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法错误的是（ ）
A．倒成平板后直接培养可判断有无污染
B．制备平板时，培养基需先灭菌再倒平板
C．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
D．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
【答案】D
【解析】平板上不含任何生长因子，若倒成平板后直接培养，出现菌落说明已被杂菌感染，因为该嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A正确；制备平板时，先灭菌再倒平板，故倒成平板后不需要进行灭菌处理，B正确；不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，C正确；图中菌落生活在乙丙区域之间，说明同时需要乙和丙，D错误。
12．养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种物质可被硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离与计数”实验中（ ）
A．需要配制添加一定浓度铵盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌
B．应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在火焰旁进行
C．可以采用平板划线法进行接种，还需与未接种的空白培养基同时培养
D．应将培养基置于30 ℃恒温下培养12 h后，统计培养基中全部菌落数
【答案】B
【解析】要分离硝化细菌，应该用以铵盐为唯一氮源的培养基，培养基中不能加入牛肉膏蛋白胨，A错误；获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染，因此，应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在火焰旁进行，B正确；对微生物进行计数时应该采用的接种方法是稀释涂布平板法，C错误；应将培养基置于37℃恒温下培养12 h后，统计菌落数在30—300之间的培养基进行计数，D错误。
二、综合题
13．放线菌是重要的抗生素产生菌，在有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。放线菌产生的抗生素抑菌效果可通过抑菌实验来获得。图一所示为分离和鉴定实验用到的部分仪器。回答下列问题：
（1）分离放线菌时所用的培养基除了含有微生物生长所必需的营养要素外，还要加入10%的酚，该药品的作用是使细菌、霉菌得以淘汰，据此判断该培养基属于___________培养基。
（2）分离采用的方法为________，②可用于______________操作，通过该操作才可在平板上得到单菌落。
（3）举出③在分离时的两个用途：____________、____________。
（4）鉴定放线菌的抑菌效果时，先将分离后经活化的放线菌接种到发酵培养液中，37℃培养3天，将培养液离心，应取离心后的________进行下一步实验。图二中A、B、C分别为涂布有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌悬液的三个平板，图中各放置了六只牛津杯（图一中的④），每个平板右侧三个杯为对照。上述制得的上清液放置的位置为______________，图中抑菌效果最好的是___________组。
【答案】（1）选择
（2）稀释涂布平板法 稀释
（3）对涂布器灭菌 形成无菌区
（4）上清液 牛津杯内 C
【解析】（1）加入10%的酚，淘汰细菌、霉菌，其目的在于筛选所需的放线菌，这类培养基称为选择培养基。
（2）根据实验所采用的实验仪器，它是用于稀释涂布平板法的工具，所以该微生物实验分离采用的方法为稀释涂布平板法。②为定量移液管，可用于稀释操作，通过该操作才可在平板上得到单菌落。
（3）③为酒精灯，在分离时要用于对涂布器灭菌和接种操作时形成一个无菌区，以减少被杂菌污染的机会。
（4）由于发酵液中培养的放线菌会分泌大量抗生素，而抗生素在发酵液中经离心后主要分布在上清液中，所以在鉴定放线菌产生的抗生素效果的实验中，应取离心后的上清液进行鉴定试验。结合图2和题意分析，鉴定试验分三组进行，每组有6个牛津杯分别盛有离心得到的上清液，其中各有3个实验组，三个对照组；对比结果可知，其中C组中有三个实验组得到的抑菌圈（图中白色区域）最大，说明该组的抑菌效果最佳。
14．某种农药M很难降解，对环境会造成一定的污染。为了从土壤中分离出能分解该农药的微生物，某科研人员进行了如图所示的实验。已知含有该农药的培养基呈乳白色，回答下列问题。
（1）该实验所用培养基，从功能上可划分为________培养基，理由是_________________。
（2）该实验过程中，将土壤稀释液接种到培养基表面的常用方法是____________。1g土壤被稀释了__________倍。
（3）根据实验结果_____________（填“能”或“不能”）较为准确的计算出土壤中微生物的数量，理由是_________________________________________。
（4）根据实验结果，可得出的结论是__________________________________。
【答案】（1）鉴定 能分解农药M的微生物和不能分解农药M的微生物均在该培养基上生长，另外能分解农药M的微生物周围会出现透明圈
（2）涂布平板法 105
（3）不能 平板上单菌落数小于30，计数结果误差大
（4）该土壤中有多种能分解农药M的微生物且不同微生物分解农药M的能力有差异
【解析】（1）该实验的目的是要筛选能分解农药M的细菌，所用培养基，从功能上可划分为鉴别培养基，目的是鉴别出能分解农药M的微生物，在分解农药M的微生物产生的菌落周围出现透明圈，而其他的不能分解农药M的微生物菌落周围不会出现透明圈。
（2）该实验过程中，将土壤稀释液接种到培养基表面通常用涂布平板法操作。图中1g土壤首先溶解到99mL无菌水中，随后又稀释了1000倍，故1g土壤被稀释了105倍。
（3）根据实验结果不能较为准确的计算出土壤中微生物的数量，因为图示平板上单菌落数小于30，统计结果误差偏大，在使用稀释涂布平板法计数时，通常选择对应的稀释倍数下涂布的菌落数在30~300范围内的进行计数。
（4）平板上显示了三个大小不同的菌落，且透明圈的大小也各不相同，显然说明是该土壤中有多种能分解农药M的微生物且不同微生物分解农药M的能力有差异。
15．在白酒发酵的窖池中，当培养液的pH≤4.5时，酵母菌的代谢活动逐渐受到抑制，甚至停止。耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种，为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌，研究者进行了相关实验，请回答下列有关问题：
（1）在发酵过程中，窖池中培养液的pH会逐渐下降，原因是_________________________。
（2）取窖底泥，溶于10mL无菌水中，再取1mL 上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养，其目的是_____________________，2天后分别接种到不同酸碱度的麦芽汁培养基上，培养结果见下表。为选择合适的菌种，根据培养结果，可从表格中pH范围为_________的培养基中获得菌种。注：“+”越多表示菌体长得越好
pH=5
pH=4
pH=3
pH=2.5
pH=2
+++++
++++
+++
++
+
（3）通过图示_____________法进行纯化培养，取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，要将涂布器___________后才能进行操作。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3个平板上菌落数分别为99个、92个、94个，则可以推测酵母菌液中每毫升含菌数为_____个。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是_____________。
（4）实验获得了三个耐酸性较强的酵母菌菌株，特点如下表。
菌株
A
B
C
特点
pH≤3.5时，生长代谢正常、优于其它常规菌种
pH≤3.5时，生长代谢正常，pH4～6时不正常
pH2.5～6，生长代谢正常、优于其它常规菌种
依据菌株特点，研究者认为________菌株更适合作为白酒发酵菌株，作出这一判断的理由是____________________________________________________。
【答案】（1）细胞呼吸产生CO2，可形成碳酸，代谢过程还产生了其他酸性物质
（2）使得酵母菌大量繁殖 2-3
（3）稀释涂布平板法 灼烧冷却 9.5×108 有的菌落可能是由2个或多个菌体形成的
（4）C 该菌对pH的耐受范围更大，发酵初期pH近中性，C菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，C菌种依然能正常生长
【解析】（1）在发酵过程中，窖池中培养液的pH会逐渐下降的原因是：酵母菌细胞呼吸产生CO2，可形成碳酸，代谢过程还产生了其他酸性物质。
（2）取窖底泥，溶于10mL无菌水中，再取1mL 上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养，其目的是使得酵母菌大量繁殖；耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种，所以根据培养结果，可从表格中pH范围为2-3的培养基中获得菌种。
（3）图示纯化培养的方法为稀释涂布平板法；在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧冷却后才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了106倍（M），该稀释度下平板上生长的平均菌落数C＝（99＋92＋94）÷3＝95个，涂布平板时所用的稀释液的体积V＝0.1mL，根据公式可知，酵母菌液中每毫升含菌数为（C÷V）×M＝（95÷0.1）×106＝9.5×108个；由于有的菌落可能是由2个或多个菌体形成的，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。
（4）根据表格分析可知，C菌对pH的耐受范围更大，发酵初期pH近中性，C菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，C菌种依然能正常生长，所以C菌株更适合作为白酒发酵菌株。
专题33 微生物的培养与利用
考点一、微生物的实验室培养
【要点速记】
1．培养基
（1）概念：人们按照微生物对_________的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）种类：液体培养基和______________培养基，二者的区别为是否添加_____________。
（3）营养成分。
①主要营养物质：_____________、_____________、水和无机盐。
②其他条件：pH、_______________物质和氧气。
2．无菌技术
（1）目的：获得_______________________________。
（2）关键：防止___________________________的入侵。
（3）常用方法：_______________和_______________。
（4）无菌技术的主要方法及适用对象：
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：
（1）计算：依据配方比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。
（2）称量：准确地称取各种成分。
（5）倒平板：待培养基冷却至___________℃左右时，在_____________倒平板。
4．纯化大肠杆菌
（1）菌落：由____________繁殖而来的肉眼可见的_____________群体。
（2）两种常用接种方法的比较：
常用方法
平板划线法
稀释涂布平板法
纯化原理
通过接种环在________________的表面_______________操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
将菌液进行一系列的____________，然后将不同稀释度的菌液分别______________到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞
主要步骤
_______________操作
系列稀释操作和涂布平板操作
接种工具
接种环
_______________
平板示意图
相同点
都能获得单细胞菌落
不同点
平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数
5．菌种的保藏方法
主要方法
临时保藏法
甘油管藏法
保藏对象
频繁使用的菌种
____________的菌种
方法步骤
先接种到试管的_________培养基上培养，然后放入_____________的冰箱中
转入灭菌后的_____中，混匀后放在_________冷冻箱中保存
【重难点突破】
1．培养基的配制原则“三要”
（1）目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
（3）pH要适宜：一般的细菌适合于中性环境生长，放线菌适合于偏碱性环境，而酵母菌和霉菌适合于微酸性环境，配制培养基时需要根据微生物的类群调节pH。
2．消毒和灭菌的比较
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
紫外线消毒
接种室、接种箱、超净工作台等
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具等
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具等
高压蒸汽灭菌法
培养基、容器等
3．平板划线操作中灼烧接种环的目的
灼烧时间
灼烧目的
第一次划线前
杀死接种环上原有的微生物，防止外来杂菌污染培养基
第二次及以后每次划线前
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端
最后一次划线后
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
考点二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【要点速记】
1．筛选菌株
（1）寻找目的菌株的方法：根据它对____________的要求，到相应的环境中去寻找。
（2）实验室中微生物的筛选。
①方法：____________有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。
②实例：筛选尿素分解菌时使用以________为唯一氮源的________培养基进行培养。
（3）选择培养基：在微生物学中，允许____________的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基。
2．统计菌落数目
比较项目
间接计数法
（稀释涂布平板法）
直接计数法
（显微镜直接计数法）
原理
样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的___________活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定_______________________或_____________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌株数= _____________
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是____________
不能区分细胞死活
误差
比实际值偏____________
比实际值偏____________
细菌的数目还可以通过_______来测定
3．设置对照和重复
比较项目
对 照
重 复
目的
排除___________对实验结果的影响
排除_________对实验结果的影响
方法
空白对照：确定培养基制作是否合格；条件对照：用________培养基与选择培养基对照，说明选择培养基具有选择作用
同一稀释度涂布至少_________个平板
4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5．分解尿素的细菌的鉴别
（1）方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入___________指示剂培养分解尿素的细菌。
（2）原理：
（3）实验现象及结论：
①培养基变红：该种细菌_______________分解尿素。
②培养基不变红：该种细菌___________分解尿素。
6．微生物的观察：
一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的____________，包括________的________、大小、____________和______________等方面。
【重难点突破】
1．选择培养基的制作方法
2．两种纯化细菌方法的辨析
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
考点三、分解纤维素的微生物的分离
【要点速记】
1．纤维素酶
2．纤维素分解菌的筛选
3．实验流程
【重难点突破】
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
种类
选择培养基
鉴别培养基
制备方法
培养基中加入某些化学物质
培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好、抗性而设计
依据微生物产生的某种代谢产物与培养基中的特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计
用途
从众多微生物中“分离”所需的微生物，淘汰不需要的微生物
“鉴别”不同种类的微生物（注：未淘汰其他微生物）
举例
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌
2．分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较
分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
（1）选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
（2）鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。
（3）刚果红染色法应用于鉴别培养基。
要点速记答案
考点一、1．（1）营养物质 （2）固体 凝固剂 （3）碳源 氮源 特殊营养 2．（1）纯净的培养物 （2）外来杂菌 （3）灭菌 消毒 （4）a－Ⅲ－⑤、a－Ⅴ－④、a－Ⅵ－③ b－Ⅰ－⑥、b－Ⅱ－①、b－Ⅳ－② 3．（3）称量纸 蛋白胨 琼脂 （4）pH 高压蒸汽 121℃ （5）50 酒精灯火焰附近 4．（1）一个细菌 子细胞 （2）琼脂固体培养基 连续划线 梯度稀释 涂布 平板划线 涂布器 5．长期保藏 固体斜面 4℃ 甘油 －20℃
考点二、1．（1）生存环境 （2）人为提供 尿素 选择 （3）特定种类 抑制或阻止 2．一个 细菌计数板 血细胞计数板 （C÷V）×M 一个菌落 小 大 滤膜法 3．非测试因素 偶然因素 完全 3 4．脲酶 尿素 直接计数法 稀释涂布平板法 系列稀释 计数 5．（1）酚红 （2）2NH3 红色 （3）能 不能 6．菌落特征 菌落 形状 隆起程度 颜色
考点三、1．C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶 纤维二糖 葡萄糖 2．红色复合物 透明圈 刚果红 透明圈 纤维素 3．纤维素 选择培养基 鉴别纤维素分解菌
专题33 微生物的培养与利用（基础）
一、单选题
1．培养下列微生物，培养基中不用添加碳源的是（ ）
A．蓝藻 B．酵母菌 C．醋酸菌 D．毛霉
【答案】A
【解析】蓝藻是原核生物，含藻蓝素、叶绿素，能利用二氧化碳无机碳源进行光合作用合成有机物，是自养型生物，故不需要添加碳源，A正确；酵母菌是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，B错误；醋酸菌是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，C错误；毛霉是异养型生物，培养基中需要添加有机碳源，D错误。
2．细菌喜荤、霉菌喜素的意思是在配制培养基时（ ）
A．要调整培养基的pH B．要考虑不同微生物的代谢特性
C．要调整培养基的渗透压 D．要考虑不同微生物的结构特性
【答案】B
【解析】培养基的营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
3．某学生在实践酒酿酵母菌的培养探索时，对部分培养基成分进行了改良，如表。其中主要提供氮源的培养基成分是（ ）
培养基成分
用量（g）
黄豆粉
10
葡萄糖
5
琼脂
15
A．琼脂 B．黄豆粉 C．葡萄糖 D．黄豆粉和葡萄糖
【答案】B
【解析】琼脂是凝固剂，不能提供氮源，A错误；黄豆粉富含蛋白质，能够提供氮源，B正确；葡萄糖只含C、H、O三种元素，不能提供氮源，C错误；黄豆粉能够提供氮源，但葡萄糖不能提供氮源，D错误。
4．在分离和纯化土壤中自生固氮菌的实验中，不合理的操作是（ ）
A．取土表3-5cm以下土层的土壤 B．用无菌水稀释土壤样品
C．使用牛肉膏蛋白胨培养基 D．用接种环进行划线接种
【答案】C
【解析】土表3-5cm以上的土壤比较干燥，自生固氮菌的数量较少，因此取土表3-5cm以下土层的土壤，A正确；用无菌水稀释土壤样品，否则可能造成土壤被杂菌污染，B正确；自生固氮菌可以在缺乏氮源的培养基中生存，牛肉膏蛋白胨培养基含有氮源，用其分离出的微生物既有自生固氮菌也有其他的杂菌，无法纯化自生固氮菌，C错误；接种自生固氮菌时可用接种环进行划线接种，也可用涂布器用稀释涂布平板法接种，D正确。
5．关于微生物的营养，说法正确的是（ ）
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B．凡是碳源都能提供能量
C．除水以外的无机物仅提供无机盐 D．无机氮源也可能提供能量
【答案】D
【解析】对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如牛肉膏，A错误；CO2和N2是无机物，也是某些微生物的碳源和氮源，B错误；有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量，C错误；自然界中一些微生物如硝化细菌，可以以无机氮源合成细胞物质，同时通过氧化外界无机物获得生长所需能量，叫做化能合成作用，D正确。
6．灭菌的标准是（ ）
A．杀死所有的细菌 B．杀死所有的微生物的细胞、芽孢和孢子
C．杀死所有的病原微生物 D．使病原菌不生长
【答案】B
【解析】菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子），B正确。
7．如图为实验室培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列说法正确的是（ ）
A．步骤①中待培养基冷却后才能盖上培养皿盖
B．步骤④中接种环共需5次灼烧处理
C．将接种后的图④平板放入培养箱中培养时无需倒置
D．①②③步骤操作时都需要在酒精灯火焰旁进行
【答案】D
【解析】步骤①将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中应立即该上培养皿盖，A项错误；每次划线前后都要对接种环进行灼烧处理，因此步骤④中接种环共需6次灼烧处理，B项错误；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱培养，防止冷凝水污染培养基，C项错误；培养与纯化大肠杆菌的过程中需要在酒精灯的火焰旁进行，故①②③步骤操作时都需要在酒精灯火焰旁进行，D项正确。
8．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是（ ）
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
【答案】D
【解析】高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖，B错误；接种环火焰上灼烧后，待冷却后才可以快速挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。
9．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10％酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分别分离出（ ）
A．大肠杆菌 B．霉菌 C．放线菌 D．固氮细菌
【答案】A
【解析】大肠杆菌需要氮源，青霉素能抑制大肠杆菌生长，酚也能抑制大肠杆菌的生长，A符合题意；霉菌是真菌，在培养基中加入青霉素后，青霉素可以抑制细菌和放线菌，但是不抑制真菌，所以加入青霉素的培养基可以选择出霉菌，B不符合题意；培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌，所以可以筛选放线菌，C不符合题意；固氮细菌的氮源是氮气，在培养基中不需要氮源，所以缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，但是固氮细菌可以生长，D不符合题意。
10．微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于这两种接种方法的叙述中，不正确的是（ ）
A．都只能用于固体培养基接种 B．都能用于微生物的计数
C．接种培养后均可获得单菌落 D．接种工具使用后需要灭菌
【答案】B
【解析】将微生物接种到固体培养基中的方法通常为平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；稀释涂布平板法接种可以形成单菌落，所以常用来进行微生物的计数，平板划线法常用来筛选分离微生物，B错误；两种接种方法在培养基中均可形成单个菌落，C正确；为防止污染，接种工具使用后需要灭菌，D正确。
11．甲、乙、丙是三种微生物，下表I、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在I中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是（ ）
粉状硫
10g
K2HPO4
4g
FeSO4
0.5g
蔗糖
10g
（NH4）2 SO4
0.4g
H2O
100ml
MgSO4
9.25g
CaCl2
0.5g
I
+
+
+
+
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A．甲、乙、丙都是异养微生物
B．甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物
C．甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物
D．甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物
【答案】D
【解析】根据以上分析已知，乙属于自养微生物，A错误；甲能够在Ⅰ中正常生长繁殖，但是不能在Ⅱ培养基中生长繁殖，说明其为异养微生物，B错误；根据以上分析已知，丙属于异养微生物，C错误；根据以上分析已知，甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物，D正确。
12．细菌培养过程中分别采用高压蒸汽、酒精、火焰灼烧几种不同处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（ ）
A．接种环、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种环、手、高压锅
【答案】C
【解析】接种环应该进行灼烧灭菌，手应该用酒精消毒，培养基应该进行高压蒸汽灭菌，A错误；高压锅是灭菌工具，手应该用酒精消毒，接种环应该进行灼烧灭菌，B错误；培养基应该进行高压蒸汽灭菌，手应该用酒精消毒，接种环应该进行灼烧灭菌，C正确；接种环应该进行灼烧灭菌，手应该用酒精消毒，高压锅是灭菌工具，D错误。
13．下列有关用平板划线法和稀释涂布平板法纯化培养大肠杆菌的叙述，正确的是（ ）
①都需要用固体培养基 ②都需要使用接种针进行接种
③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用菌落数来计数活菌
A．①② B．①③ C．②④ D．③④
【答案】B
【解析】平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落，所以都需要用固体培养基，①正确；稀释涂布平板法不需要使用接种针进行接种，②错误；为防止杂菌污染，操作时都需要在火焰旁进行接种，③正确；平板划线法不能用于计数活菌，只能用于分离菌种；稀释涂布平板法可以用来计数活菌，④错误。
14．某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。 下列叙述正确的是（ ）
A．培养基分装到培养皿后进行灭菌 B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养 D．培养过程中每隔一周观察一次
【答案】B
【解析】可以直接在锥形瓶灭菌，然后再分装到灭菌过的培养皿中，如果分装到培养皿中再灭菌，不便移动操作；A错误；接种环暴露在空气中一段时间后就需再进行灼勺灭菌；B正确；微生物培养一般不需要光照条件；C错误；根据不同的微生物，间隔观察时间不同，如也可能每天定时观察。D错误。
15．下图是划线分离法接种微生物的示意图，下列叙述错误的是（ ）
A．该接种过程一般需灼烧接种环5次
B．划线结束可看到划线末端出现不连续单菌落
C．若培养的是尿素分解菌，可加入酚红指示剂
D．该接种方法不能准确计数培养液中微生物数量
【答案】B
【解析】为了防止杂菌污染，每一次的划线之前和划线操作结束后都需要将接种环灼烧灭菌，图示中共有4个划线区域，因此该接种过程一般需灼烧接种环5次，A正确；划线结束后，将培养皿倒置放在一定温度的恒温培养箱中培养一定时间后，可看到划线末端出现不连续单菌落，B错误；若培养的是尿素分解菌，因该菌合成的脲酶可将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，所以可加入酚红指示剂来予以鉴定，C正确；该接种方法（划线分离法）不易分离出单个菌落，不能准确计数培养液中微生物数量，D正确。
16．关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述中错误的是（ ）
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板
D．待平板冷却凝固约5~10 min后将平板倒过来放置
【答案】A
【解析】制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，A错误；将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热，B正确；待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，C正确；待平板冷却凝固约5〜l0min后将平板倒过来放置，以防止水蒸气凝集滴入培养基，D正确。
17．图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是（ ）
A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌
B．划线操作必须在火焰上进行
C．最可能得到所需菌落的区域是1
D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
【答案】D
【解析】操作前要将接种环放在火焰外焰中灼烧灭菌，A错误；划线操作必须在火焰附近进行，B错误；区域5是划线末端菌液最少处，最有可能得到所需的单菌落，C错误；在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌，D正确。
18．平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是（ ）
A．接种时再拿起来方便 B．在皿底上标记日期等方便
C．正着放置容易破碎 D．防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
【答案】D
【解析】微生物实验室培养的关键在于防止杂菌污染，平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，故选D。
19．下列有关分解纤维素的微生物的分离的叙述，说法错误的是（ ）
A．纤维素酶中的C1酶和CX酶可以将纤维素分解为纤维二糖
B．分离纤维素分解菌时，可在倒平板时加入刚果红染色，然后接种分解菌
C．纤维素酶的发酵方法有液体发酵法和固体发酵法
D．要增加纤维素分解菌的浓度，应使用固体培养基进行选择培养
【答案】D
【解析】纤维素酶中的C1酶和CX酶可以将纤维素分解为纤维二糖，A正确；分离纤维素分解菌时，可在倒平板时加入刚果红染色，然后接种分解菌，B正确；纤维素酶的发酵方法有液体发酵法和固体发酵法，C正确；要增加纤维素分解菌的浓度，应使用以纤维素为唯一碳源的液体培养基进行选择培养，D错误。
20．某生物兴趣小组欲配制培养基从土壤中选择尿素分解菌。下列相关叙述正确的是（ ）
A．配制以尿素为唯一氮源的液体培养基可用于选择和观察尿素分解菌
B．为获取102的稀释液可将90 mL无菌水加入10 g土壤样品中
C．实验中若需要统计尿素分解菌的菌落数目，接种时只能用平板划线法
D．实验中设置对照，同时培养一个空白培养基可检验培养基灭菌是否彻底
【答案】D
【解析】选择和观察尿素分解菌时需要配制以尿素为唯一氮源的固体培养基，A错误；10 g土壤样品加入90 mL无菌水中，振荡摇匀后可获得10倍的稀释液，B错误；实验中若需要统计尿素分解菌的菌落数目，接种时只能用稀释涂布平板法，C错误；实验中设置对照，同时培养一个空白培养基，可通过空白培养基上是否有菌落来判断培养基灭菌是否彻底，D正确。
21．某同学依据下图操作步骤，从土壤中分离以尿素为氮源的微生物。其中尿素固体培养基和尿素液体培养基均以尿素为唯一氮源。下列叙述正确的是（ ）
A．尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂
B．以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是过滤灭菌
C．利用液体培养基的培养需要振荡以提高营养成分的利用率
D．两种步骤获得的菌落比值相等（甲1/甲2＝乙1/乙2）
【答案】C
【解析】尿素固体培养基比尿素液体培养基多了琼脂和酚红指示剂，A错误；以尿素为唯一氮源的培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，其中的尿素用过滤灭菌，B错误；利用液体培养基进行培养的过程中，通过振荡可以提高营养成分的利用率，C正确；两种步骤获得的菌落比值关系为（甲1/甲2＞乙1/乙2），因为后者经过了对尿素分解菌的选择培养，所以尿素分解菌的比例变多，D错误。
22．下列检测某熟制食品中大肠杆菌是否超标的实验操作，不合理的是（ ）
A．待检测食品需要经过灭菌操作后取样检测
B．应设置未接种的培养基，作为实验的对照
C．用稀释涂布平板法接种计数大肠杆菌的活菌数
D．接种后将培养皿倒置并在适宜温度下培养
【答案】A
【解析】待检测食品灭菌后会将大肠杆菌杀死，则不能检测大肠杆菌是否超标，A错误；应设置未接种的培养基，作为实验的对照，B正确；用稀释涂布平板法接种计数大肠杆菌的活菌数，C正确；接种后应该将培养皿倒置，并在适宜温度下培养，D正确。
二、综合题
23．回答下列有关微生物培养和利用的有关问题：
（1）按照培养基的成分来分，培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。
①在酿制葡萄酒时，葡萄汁就相当于是酵母菌发酵的天然培养基。在_____________的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应而受到抑制。
②虽然各种培养基的具体配方不同但一般都含碳源、氮源、无机盐和水。培养基中能同时提供碳源和氮源的成分是_______________（“蛋白胨”“葡萄糖”“NaNO3”）。
（2）按照培养基用途来分，培养基按其特殊用途可分为富集培养基、选择性培养基和鉴别培养基。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作________________。在选择培养基中添加一些特殊的物质，则可配制成鉴别培养基。如在尿素为唯一氮源的培养基中加入_______________，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，则可初步鉴定为该种细菌能够分解尿素；在纤维素为唯一碳源的培养基中加入______________，当纤维素被分解后，其与纤维素形成的红色复合物就无法形成。
（3）微生物培养中，稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为______________________________________。
【答案】（1）缺氧、呈酸性 蛋白胨
（2）选择培养基 酚红指示剂 刚果红
（3）当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
【解析】（1）①在酿制葡萄酒时，葡萄汁就相当于是酵母菌发酵的天然培养基，酵母菌为兼性厌氧型微生物，在氧气充足条件下，能进行有氧呼吸并大量繁殖，在无氧条件下能进行酒精发酵，在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应而受到抑制。
②虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含碳源、氮源、无机盐和水。培养基中能同时提供碳源和氮源的成分是蛋白胨。
（2）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。在选择培养基中添加一些特殊的物质，则可配制成鉴别培养基。如在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，则可初步鉴定该种细菌能够分解尿素，产生NH3；在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，由于刚果红能和纤维素结合形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）微生物培养中，稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目。然而当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
24．尿素是一种重要的农业氮肥，但是并不能直接被农作物吸收。土壤中含大量微生物，其中就有尿素分解菌。某兴趣小组欲从土壤中分离该类细菌，并进行后续培养研究，设计了如下实验：
请回答有关问题：
（1）称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是_____________。
（2）该兴趣小组设计了A、B两种培养基（成分见下表）：
葡萄糖
无机盐
尿素
琼脂
酚红溶液
水
培养基A
＋
＋
＋
＋
＋
＋
培养基B
＋
＋
＋
－
＋
＋
注：＋表示有，－表示无
据表分析，两种培养基的碳源是________________；培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化，原因是________________________。接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察_______________进行初步鉴定。
（3）加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是________________。配置好的培养基灭菌方法是_______________________。
（4）若用平板划线法接种微生物，在培养基上共画了4个区域，则至少需要__________次灼烧接种环。
【答案】（1）防止空气中的杂菌污染
（2）葡萄糖 分离微生物需要用固体培养基或者液体培养基不能用于分离纯化 培养基是否变红（培养基颜色）
（3）为细菌生长提供营养物质，调节pH值 高压蒸汽灭菌法
（4）5次
【解析】（1）微生物培养的关键是无菌操作，称取土壤、梯度稀释、接种微生物需要在火焰旁进行，其目的是防止杂菌污染。
（2）由表可知，两种培养基的碳源是葡萄糖；培养基A和培养基B的区别是有无琼脂，即培养基A为固体培养基，培养基B为液体培养基，分离微生物需要用固体培养基，故培养基B可用于增菌培养，不能用于分离纯化。由鉴定分解尿素细菌的原理可知，接种的微生物中是否含有尿素分解菌，可通过观察培养基是否变红进行初步鉴定。
（3）加入培养基的无机盐含有KH2PO4及Na2HPO4，其作用是为细菌生长提供营养物质，调节pH值。培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌法。
（4）采用平板划线法纯化微生物时，每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后还需灼烧接种环，若划线时在培养基上共画了4个区域，则需要5次灼烧接种环。
25．牛奶消毒不过关容易携带细菌。根据国家标准（GB19645—2010）规定，每毫升合格的牛奶细菌总数不能超过50000个。某兴趣小组利用恒温水浴锅对新鲜牛奶进行消毒然后检测消毒的效果，如下图所示。
（1）图中步骤①对牛奶的消毒的方法是_____________，一般采用__________对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，蛋白胨的作用有________________________________（写两点）。
（2）步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成___________。步骤③的接种方法是_______________，这种方法可以用来统计样品中活菌的数目，其原理是___________________________________________________________。
（3）兴趣小组通过步骤①～③接种了3个平板和1个未接种的平板放入恒温培养箱，在适宜的温度条件下培养48h，然后统计出4个平板上的菌落数分别是57、53、55和9。根据这样的实验结果________（填“能”或“不能”）判断该兴趣小组消毒后的牛奶细菌超标，原因是_________________________________。
（4）如果要检测牛奶中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入____________（填物质），观察是否出现黑色（或蓝黑色）的菌落。
【答案】（1）巴氏消毒 高压蒸汽灭菌 提供碳源、氮源等
（2）单个菌落 稀释涂布平板法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌
（3）不能 因为未接种的培养基上有菌落出现，说明培养基灭菌不彻底，则其它培养基上的菌落数不能表示牛奶中细菌数量
（4）伊红美蓝
【解析】（1）图中步骤①对牛奶的消毒方法是巴氏消毒，既可以杀灭牛奶中的微生物，又可以使牛奶中的营养成分不会被破坏。对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法，蛋白胨含多种有机物，能为微生物提供碳源、氮源、维生素等。
（2）步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成单个菌落。步骤③的接种方法是稀释涂布平板法，这种方法可以用来统计样品中活菌的数目，其原理是样品稀释度足够高时，稀释液中的一个活菌可在平板上长出一个单菌落，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。
（3）由于未接种的平板上也有菌落，说明培养基灭菌不合格，则其它培养基上的菌落数不能表示牛奶中细菌数量，故不能由上述平板上菌落数计算消毒后的牛奶细菌是否超标。
（4）伊红美蓝可使大肠杆菌的菌落呈现黑色，所以要检测牛奶中是否含有大肠杆菌，需要在培养基中加入伊红美蓝，观察是否出现黑色（或蓝黑色）的菌落。
专题33 微生物的培养与利用（提高）
一、单选题
1．为了筛选出能产生脲酶的微生物，应当从下列哪一种环境中选择（ ）
A．施用尿素较多的农田 B．施用氨肥较多的农田
C．施用磷肥较多的农田 D．落叶较多的地方
【答案】A
【解析】脲酶可以将尿素分解为二氧化碳和氨气，其底物为尿素，因此筛选能产生脲酶的微生物，应当从尿素较多的农田中获得， BCD错误，A正确。
2．下列关于无菌操作的叙述，错误的是（ ）
A．煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
B．加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
C．利用组织培养技术繁殖脱毒苗时，需要对植物的外植体进行消毒
D．接种时灼烧接种环要冷却后再对菌种划线
【答案】B
【解析】100℃煮沸5~6min可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，A正确；指示剂和染料可能混有微生物，故加入培养基前需灭菌，B错误；利用组织培养技术繁殖脱毒苗时，为防止细菌污染，应对外植体进行消毒，C正确；接种时灼烧接种环要冷却后再对菌种划线，以免接种环温度太高，杀死菌种，D正确。
3．下列有关微生物培养的叙述，正确的是（ ）
A．培养过微生物的培养基经灭菌后仍可用于培养微生物
B．涂布接种时，要待涂布器上酒精燃尽后冷却再使用
C．对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿盖标记便于观察
D．长期保存菌种时，可以采用甘油管藏的方法，放在 4℃冰箱中保存
【答案】B
【解析】培养过微生物的培养基应该经灭菌后扔掉，A错误；涂布接种时，应该将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s，B正确；对培养皿进行标记时，应该在皿底进行标记，C错误；长期保存菌种时，可以采用甘油管藏法，放入-20度的冷冻箱中保存，D错误。
4．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是（ ）
A．链霉素能阻止结核菌的生长
B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
【答案】D
【解析】抗生素是真菌（另外还有放线菌）产生的可杀死某些致病菌的物质，可以用来治疗相应的疾病。如图所示，实验结果表明，链霉菌产生的链霉素是一种抗生素类物质，它可以抑制某些细菌的繁殖。分析实验结果可以看出：链霉素对结核杆菌的抑制作用最强，对霍乱菌的抑制作用较弱，对伤寒菌几乎无抑制作用，ABC正确，D错误。
5．不同的微生物对营养物质的需要各不相同。下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物的描述中，不正确的是（ ）
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮元素 B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质 D．水是该微生物的营养物质之一
【答案】B
【解析】氮源物质为该微生物提供必要的氮素，A正确；该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质，B错误；无机盐是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；水是该微生物的营养物质之一，D正确。
6．在做分离“分解尿素的细菌”实验时，A同学从对应10-6培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。下列有关叙述不正确的是（ ）
A．A同学出现这种结果的原因可能是土样不同
B．可以将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染
C．让其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一样，则可证明A同学无误
D．B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，而C选项的没有
【答案】D
【解析】A同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作中污染造成的，A正确；A同学的实验结果可能是培养基污染造成的，可以将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，B正确；如果是A同学实验操作过程中污染造成的，让其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一样，则可证明A同学无误，C正确；B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则，D错误。
7．为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
【答案】B
【解析】倒平板后无需晃动，A错误；Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落，说明细菌数量太多，故应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，C错误；刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，D错误。
8．产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是（ ）
A．使用平板划线法可以在⑥上获得单个菌落
B．如果要测定②中的活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
D．微生物培养前，需对培养基和培养皿进行消毒处理
【答案】D
【解析】平板划线法可分离微生物，可获得单个菌落，A正确；利用稀释涂布平板法可对微生物进行计数，B正确；图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源，以扩大降解苯酚的微生物的浓度，C正确；微生物培养前，需对培养基和培养器皿进行灭菌处理，D错误。
9．下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述中，错误的是（ ）
A．平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
B．用富含尿素的培养基富集培养尿素分解菌
C．稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D．用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大
【答案】A
【解析】平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散，但无法计数，A错误；用富含尿素的培养基富集培养尿素分解菌，B正确；稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散，C正确；用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往偏大，因为有些死菌也被计入其中，D正确。
10．茶叶中含多种物质，其中茶多酚具有杀菌消炎作用。为研究茶多酚的抑菌效果，研究人员进行了相关实验。下表所示为在不同pH、茶多酚浓度为40g/L时的实验结果。
菌种
抑菌圈直径（mm）
pH=4
pH=5
pH=6
pH=7
pH=8
pH=9
pH=10
沙门氏菌
14．0
13．7
13．8
14．3
15．5
14．6
12．5
蜡状芽孢杆菌
16．0
15．5
14．7
15．7
17．4
15．6
13．5
大肠杆菌
11．8
12．9
12．7
13．8
15．0
14．4
12．8
结合表中数据分析，可得到的结论是（ ）
A．不同pH条件下，茶多酚对同一种细菌的抑制效果不同
B．相同pH条件下，茶多酚对三种细菌的抑制效果相同
C．茶多酚对三种细菌的抑制效果均最强时的最适pH是7
D．浓度为40g/L的茶多酚是抑制三种菌繁殖的最适浓度
【答案】A
【解析】不同pH条件下，茶多酚对同一种细菌的抑制效果不同，A正确；任选一个pH值对比即可发现茶多酚对不同细菌产生的抑菌圈直径是不同的，所以相同pH条件下，茶多酚对三种细菌的抑制效果不同，B错误；找出每一行细菌抑菌圈最大值对应的pH值，可知茶多酚对三种细菌的抑制效果均最强时的最适pH是8，C错误；本题中未比较其他浓度的茶多酚抑菌效果，因此不能判断40g/L是否为抑制三种菌繁殖的最适浓度，D错误。
11．下列关于微生物培养和分离的说法中，正确的是（ ）
A．先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，立即出现有透明圈的菌落
B．筛选纤维素分解菌的实验流程中不可省略选择培养这一步
C．菌落的大小、颜色、有无荚膜、隆起程度等特征都可作为菌种肉眼鉴定的依据
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌
【答案】D
【解析】先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，此种方法需用氯化钠洗去浮色，再观察出现有透明圈的菌落，A错误；选择培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌少，B错误；菌落的大小、颜色、隆起程度等特征都可作为菌种鉴定的依据，但是有无荚膜通过肉眼无法观察，C错误；在只含有尿素作为氮源的培养基中加入酚红指示剂可初步鉴定尿素分解菌，D正确。
12．秸秆还田可增加土壤肥力，缓解环境污染。为分离分解纤维素的微生物菌种，实现废物的资源化利用，研究人员设计了“土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌株”的实验流程。下列叙述错误的是（ ）
A．配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之后调节pH
B．选择培养时，应使用纤维素为唯一碳源的培养基
C．进行梯度稀释时，应在酒精灯火焰旁完成各种操作
D．挑选菌株后，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃
【答案】A
【解析】配制培养基时，应在高压蒸汽灭菌之前调节pH，避免灭菌之后调pH造成杂菌污染，A错误；选择培养时，为分离分解纤维素的微生物菌种，应使用纤维素为唯一碳源的培养基，B正确；进行梯度稀释时，为了无菌操作，应在酒精灯火焰旁完成各种操作，C正确；挑选菌株后，为了防止造成污染，应将使用过的培养基进行灭菌后再丢弃，D正确。
13．尿素分解菌可将土壤中的尿素分解成CO2和NH3供植物利用。下列关于土壤中尿素分解菌的分离和计数的叙述，错误的是（ ）
A．尿素分解菌能分解尿素是因为能合成脲酶
B．培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性
C．用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌
D．若用稀释涂布平板法计数，统计的细菌数往往比活菌的实际数目多
【答案】D
【解析】尿素分解菌可以合成脲酶，将尿素分解成CO2和NH3，A正确；培养尿素分解菌时，培养基的pH要调至中性或微碱性，B正确；用稀释涂布平板法接种后，培养基上会出现单个的尿素分解菌，C正确；由于两个或多个细菌可能形成一个菌落，所以用稀释涂布平板法接种，统计的数目比实际的数目少，D错误。
14．黑茶是利用微生物的酶促进茶多酚氧化的发酵茶。研究人员对黑茶中的微生物进行了分离和鉴定，过程如图所示。下列相关叙述不正确的是（ ）
A．向样品中加入无菌水制成样品悬液
B．可根据菌落特征对菌种进行初步鉴定
C．涂布平板上长出的菌落可通过划线法进一步纯化
D．斜面培养基含大量营养物质，常温下可长期保存
【答案】D
【解析】制备样品悬液时应向黑茶样品中加入无菌水，A正确；可以根据菌落的形状、大小等菌落特征对菌种进行初步的鉴定或分类，B正确；涂布平板上长出的菌落，可通过平板划线法进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
15．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法中，错误的是（ ）
A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
C．如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
【答案】D
【解析】土壤是微生物的天然培养基，土壤中各类微生物的数量不同，获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离，A正确；土壤中细菌总量高于定土壤中能分解尿素的细菌的数量，所以选用的稀释范围不同，B正确；稀释涂布平板法进行计数时，得到了3个或3个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，C正确；选择培养基的菌落数目明显小于牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落，D错误。
二、综合题
16．研究人员欲从土壤中分离出高效分解尿素的尿素小球菌，进行了一系列操作。回答下列相关问题：
（1）为了获得尿素小球菌，可在含尿素较多的土壤中取样，并应选用以__________为唯一氮源的培养基进行选择培养。除氮源外，培养液还应含有__________等营养物质。
（2）培养基中的琼脂属于多糖类物质，但是它并不能为尿素小球菌提供碳源，原因是____________________________________________________________________________。
（3）对采集的土壤样品一般先用____________进行稀释，再进行平板培养，从中选出菌落数在____________间的平板计数。该方法计数的结果往往偏小，原因是__________________。
（4）对分离得到的尿素小球菌作进一步鉴定时，可在上述培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红的原因是______________________，再结合菌落的特征等进行确定。
（5）将获得的3种待选微生物甲、乙、丙分别接种在相同的选择培养基中培养，其他营养物质充裕、条件适宜，观测从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为23 h、17 h、29 h，则应选择微生物__________作为菌种进行后续培养。
【答案】（1）尿素 碳源、水、无机盐
（2）尿素小球菌细胞中缺乏分解琼脂的酶
（3）无菌水 30~300 当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数
（4）尿素小球菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强 乙
【解析】（1）为了获得尿素小球菌，可在含尿素较多的土壤中取样，并应选用以尿素为唯一氮源的培养基进行选择培养。培养基营养组成一般都含有氮源、碳源、水和无机盐等营养物质。
（2）由于尿素小球菌细胞中缺乏分解琼脂的酶，所以培养基中的琼脂虽属于多糖类物质，但是它并不能为尿素小球菌提供碳源。
（3）对采集的土壤样品一般先用无菌水进行稀释，再进行平板培养，从中选出菌落数在30~300间的平板计数。该方法计数的结果往往偏小，原因是当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数。
（4）对分离得到的尿素小球菌作进一步鉴定时，可在上述培养基中加入酚红指示剂，由于尿素小球菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，进而使酚红指示剂变红。
（5）由题意可知，微生物乙在选择培养基中从实验开始到停止生长所用的时间较微生物甲、丙短，说明微生物乙分解尿素的能力比甲、丙更强，所以应选择微生物乙作为菌种进行后续培养。
17．某种物质S（一种含有C、H、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
（1）实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用_________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_________________。甲、乙培养基均属于________________培养基。
（2）实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107 个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释__________倍。
（3）在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是__________________________________________（答出1点即可）。
（4）若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤________________。
（5）上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即____________________。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
（2）104
（3）S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
（4）取淤泥加入无菌水，涂布（或稀释涂布）到乙培养基上，培养后计数
（5）水、碳源、氮源和无机盐
【解析】（1）常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶，乙为固体培养基，故需要加入Y琼脂；甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株，故均属于选择培养基。
（2）若要在每个平板上涂布100μL稀释液后的菌液，且每个平板上长出的菌落数不超过200个，则摇瓶M中的菌液稀释的倍数至少为2×107÷1000×100÷200=1×104倍。
（3）当培养基中的S超过某一浓度后，可能会抑制菌株的生长，从而造成其对S的降解量下降。
（4）要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数，可以取淤泥加无菌水制成菌悬液，稀释涂布到乙培养基上，培养后进行计数。
（5）甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源。
18．研究发现一些嗜冷细菌产生的蛋白酶可使乳蛋白分解，导致牛奶变质。为了筛选检测变质牛奶中的嗜冷细菌，某研学小组做了如图所示实验。（注：培养皿旁的数字代表菌落数目），请回答下列问题：
（1）牛奶饮用前要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，与煮沸消毒相比，巴氏消毒的牛奶在常温（约28℃）下保存时间较短，原因是_________，导致牛奶中营养成分被分解而变质。
（2）若要筛选嗜冷细菌，应将牛奶样品稀释液接种在以_________为唯一氮源的固体培养基上，并且在______的环境条件下培养，以利于嗜冷细菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。
（3）据图分析，研学小组采用的是________________法分离和计数嗜冷细菌。
（4）用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？_________（填“需要”或“不需要”），其原因是_____________________________________________。
（5）按照菌落计数的要求，据图可得出1ml牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为__________个，与用血球计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较_______________。
【答案】（1）（巴氏消毒的）牛奶中没有被杀死的微生物（或细菌）在适宜温度（或常温）下大量繁殖
（2）乳蛋白 低温（或较低温度）
（3）稀释涂布平板
（4）需要 需要证明（或判断）培养基是否被杂菌污染（培养基灭菌是否合格）
（5）3.9×105 少
【解析】（1）由于巴氏消毒的温度为75~80℃之间，有些微生物在此温度下没有被杀死，故在适宜温度（或常温）下，（巴氏消毒的）牛奶中没有被杀死的微生物（或细菌）会大量繁殖，导致牛奶中营养成分被分解而变质。所以巴氏消毒的牛奶在常温（约28℃）下保存时间较短。
（2）由于嗜冷细菌产生的蛋白酶可使乳蛋白分解，故要筛选嗜冷细菌，应将牛奶样品稀释液接种在以乳蛋白为唯一氮源的固体培养基上，并且在低温的环境条件下培养，以利于嗜冷细菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。
（3）根据图示中将牛奶样品稀释后涂在培养基上进行菌落计数，可知研学小组采用的是稀释涂布平板法分离和计数嗜冷细菌。
（4）由于不知道制备的培养基是否被污染，故需要设置不接种微生物的培养基进行对照，以证明（或判断）培养基是否被杂菌污染（培养基灭菌是否合格）。
（5）菌体计数时应选择菌落数在30~300之间的稀释倍数进行计数，由图中菌落数量可知，应选择稀释103的进行计数，故1ml牛奶样品中嗜冷细菌的活菌数为（36+39+42）÷3÷0.1×103=3.9×105个。该种方法计数时，计数的是活菌的数量，且当两个或多个菌体连在一起生长时，平板上观察的只是一个菌落，故与用血球计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较小。
19．多环芳烃菲在染料、杀虫剂等生产过程中被广泛使用，是土壤、河水中常见的污染物之一。下图表示科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解多环芳烃菲的菌株Q的主要步骤。请回答：
（1）步骤①→③的培养过程中，需将锥形瓶放在摇床上振荡，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能__________________________________。
（2）步骤④用平板划线法纯化菌株Q过程中，在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是_________________________________________，同时需要相同条件下培养不接种的培养基平板做对照，采用固体平板培养基培养细菌时要倒置培养，其目的是______________________________。
（3）接种环通过灼烧灭菌，完成步骤④中划线操作，共需灼烧接种环________次。
（4）为了获得分解多环芳烃菲能力更强的菌株，研究人员又对菌种Q进行了诱变处理，得到突变株K。为了进一步鉴定菌株K并比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力，设计了下列实验，请补全实验步骤：
①取9只锥形瓶均分成三组，编号A、B、C
②向A、B、C三组锥形瓶中加入_______________________________________的培养液。
③向A、B、C三组培养液中分别加入___________________________________________。
④28℃恒温培养3天后，测定_________________________________________________。
【答案】（1）增加培养液中的溶氧量（或增加培养液中的含氧量）
（2）线条末端细菌的数目比线条起始处要少（或能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落） 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基（或避免培养基中水分的过快挥发）
（3）6
（4）等量的以多环芳烃菲为唯一碳源 等量的无菌水、菌株Q菌液和突变株K菌液 锥形瓶中多环芳烃菲的降解率
【解析】（1）步骤①→③的培养过程中，需将锥形瓶放在摇床上振荡，目的有两个，一方面使菌株与培养液充分接触，提高营养物质的利用率；另一方面能增加培养液中的溶氧量。
（2）步骤④用平板划线法纯化菌株Q过程中，由于线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线．采用固体平板培养细菌时要倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
（3）接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次。
（4）本实验的目的是比较两种菌株降解多环芳烃菲的能力。实验设计需要遵循对照原则，对照组需加入等量无菌水；还需遵循单一变量原则，单一变量是菌种类比不同，即菌株Q菌液和突变株K菌液，所以实验设计如下：
①取9只锥形瓶均分成三组，编号A、B、C。
②向9支锥形瓶中分别加入等量以多环芳烃菲为唯一碳源的培养液。
③向A、B、C三组培养液中分别加入等量的无菌水、菌株Q菌液和突变株K菌液。
④28℃恒温培养3天后，测定锥形瓶中多环芳烃菲的降解率。
专题33 微生物的培养与利用（挑战）
一、单选题
1．下列有关微生物的培养和分离的叙述，正确的是（ ）
A．灼烧接种环后，为避免其他杂菌的干扰，应立即伸入菌液取菌种
B．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
C．在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的相同
D．若对大肠杆菌进行计数，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
【答案】B
【解析】接种环必须冷却后，才可以伸入菌液中蘸取一环液，否则会烧伤或烧死微生物，A错误；可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，若空白培养基上有菌种出现，则证明培养基被污染，B正确；在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的不相同，第一次灼烧接种环的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养基，而每次划线前灼烧接种环的目的杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，C错误；由于在稀释涂布平板法中，可能会发生多个微生物形成一个菌落的情况，因此涂布平板法统计的大肠杆菌数目会比实际值偏小，D错误。
2．原油（黑褐色黏稠的油状液体）泄漏造成的污染很难清除，我们可以从受原油污染的土壤或海水中筛选出能高效降解原油的菌株。下列有关叙述错误的是（ ）
A．配制选择培养基时需提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制其他微生物生长
B．在供氧充足的条件下培养、分离目的菌株可避免无氧呼吸产物造成的二次污染
C．接种前对菌种进行稀释的目的是使粘在一起的菌体分散开，便于菌株的分离
D．若三个平板上菌落数分别为276、159、32，则平均菌落数约为156
【答案】D
【解析】对微生物的筛选，应人为提供有利于目的菌株生长的条件如营养、温度、PH值等，同时抑制或阻止其他微生物的生长，A正确；微生物在厌氧条件下不能将有机物彻底氧化分解，产生的不彻底氧化产物会导致土壤受到二次污染，B正确；稀释的目的是使粘在一起的菌体分散开，将菌体分散成单个细胞，便于后面在平板上获得单个菌落，C正确；由于三个数值差别太大，可信度差，D错误。
3．圆褐固氮菌具有较强的固氮能力（将大气中的N2固定成NH3），并且能够分泌植物生长素，促进植株生长和果实发育。某研究小组从土壤中分离固氮菌并进行计数，然后制成菌肥施入土壤中以增加土壤肥力，提高农作物的产量。下列有关说法正确的是（ ）
A．圆褐固氮菌固定的氮能直接被植物吸收利用
B．可用酚红对选择培养的圆褐固氮菌进行鉴定
C．筛选圆褐固氮菌的培养基中要加入有机氮源
D．可通过平板划线法对所培养的菌落进行计数
【答案】B
【解析】生物固氮生成的NH3经过土壤中硝化细菌的作用，最终转化成硝酸盐，硝酸盐可以被植物吸收利用，A错误；酚红指示剂在pH升高后将变红，而圆褐固氮菌固氮产生的氨使得pH升高，因此可用酚红对选择培养的圆褐固氮菌进行鉴定，B正确；圆褐固氮菌具有固氮能力，因此筛选圆褐固氮菌的培养基中不要加入有机氮源，C错误；平板划线法只能用于菌种的分离，不能用于菌种的计数，D错误。
4．将从种植烟草的土壤里分离得到的尼古丁（C10H14N2）降解菌株SC接种到尼古丁培养基中，30℃摇床培养并定时取样，测定并计算发酵液中的尼古丁浓度和菌体浓度，得到的结果如图所示。下列分析不正确的是（ ）
A．分离SC时可用稀释涂布平板法或划线法
B．培养36h时SC的数量为该种群的环境容纳量
C．影响SC种群密度变化的主要因素是O2浓度和pH
D．发酵液中的尼古丁为SC提供碳源和氮源
【答案】C
【解析】平板划线法和稀释涂布平板法均可分离和提纯细菌，A项正确；培养36h时，SC的数量达到最大值，为该种群的环境容纳量，B项正确；根据题意可知，尼古丁是SC的主要营养物质，为SC提供碳源和氮源，再结合曲线图可推知，影响SC种群密度变化的主要因素是培养基中尼古丁的含量，C项错误，D项正确。
5．生物燃料是指以纤维素材料为原料生产的燃料乙醇和生物柴油，筛选出能高效分解纤维素的纤维素分解菌是制造生物燃料的重要前提。下列说法正确的是（ ）
A．能够分解纤维素的酶是一种复合酶，其中葡萄糖苷酶能把纤维素分解为纤维二糖
B．在筛选纤维素分解菌的过程中，刚果红染色法能通过颜色反应直接筛选微生物
C．倒平板时加入刚果红染色，优点是显示的颜色反应基本上就是纤维素分解菌的作用
D．用平板划线法对纤维素分解菌进行计数时，应选菌落数在30-300之间的平板计数
【答案】B
【解析】由分析可知，纤维素酶是一种复合酶，至少含有三种组分，即C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶，其中C1酶、Cx酶能把纤维素分解为纤维二糖，A错误；在筛选纤维素分解菌的过程中，发明了刚果红染色法，刚果红染色法能通过颜色反应直接筛选微生物，B正确；由分析可知，倒平板时加入刚果红染色是第二种方法，其优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，而显示的颜色反应基本上就是纤维素分解菌的作用是方法一的典型优点，C错误；用稀释涂布平板法对纤维素分解菌进行计数时，应选菌落数在30-300之间的平板计数，D错误。
6．某同学检测泡菜滤液中的亚硝酸盐含量，并分离纯化其中的乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而 不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜滤液显色的深浅与其中亚硝酸盐的含量呈正相关
B．培养适宜时间后，应挑选出具有透明圈的菌落
C．若要调节培养基的 pH，应该在灭菌之前进行
D．挑选出来的菌落可直接进行涂布分离
【答案】D
【解析】在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料．将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测对比，可以大致估算出亚硝酸盐的含量，所以泡菜滤液显色的深浅与其中亚硝酸盐的含量呈正相关，A正确；由于乳酸菌产生的乳酸将培养基的碳酸钙分解，所以会出现透明圈，因此培养适宜时间后，应挑选出具有透明圈的菌落，B正确；培养基的配制时需要先调节pH，在进行灭菌，避免杂菌的污染，C正确；挑选出来的菌落要先进行稀释在进行涂布，D错误。
7．勤洗手是预防病毒感染的有效措施。某公司在防控新型冠状病毒（2019-nCOV）期间推出一款新型免洗洗手凝胶。为衡量该凝胶的清洗效果，研究人员检测了凝胶洗手前后，手部细菌的含量。凝胶洗手前的检测流程见下图。下列叙述正确的是（ ）
A．统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是平板划线法
B．除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养
C．培养基上的一个菌落只可能来源于样品稀释液中的一个活菌
D．初步判断培养基上菌种的类型，需要用显微镜观察菌体的形状
【答案】B
【解析】平板划线无法得知稀释倍数，不能用于活菌计数，故统计洗手前手部细菌的数量，选择的接种方法是稀释涂布平板法，A错误；除图中操作外，还需要设置一组未接种的空白培养基进行培养，验证培养基是否被杂菌污染，B正确；由于当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落，故培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个、甚至几个活菌，C错误；由于菌落肉眼可见，故初步判断培养基上菌种的类型，可用肉眼观察菌体的形态特征，D错误。
8．将同一土壤样本经灭菌和未灭菌处理后．分别放在两个培养皿中，在土壤表面分别放3张废纸（主要成分是纤维素）。然后将两个培养皿放在有较高湿度的培养室中，4~6周后观察两个培养皿的变化情况（如下图）。下列相关叙述错误的是（ ）
A．土壤微生物能够将废纸中的有机物分解成无机物
B．将培养皿和土壤灭菌的方法可以是高压蒸汽灭菌
C．若土壤湿度不够，可加入些清水以控制无关变量
D．若某酵母菌不能利用废纸，可能是由于缺乏相应分解酶系
【答案】C
【解析】废纸的主要成分是纤维素，土壤中分解纤维素的微生物可以利用废纸中的纤维素获取物质和能量，A正确；培养皿和土壤既可以采用干热灭菌，又可以采用高压蒸汽灭菌，B正确；若土壤湿度不够，可加入些无菌水，以控制湿度对实验结果的影响，C错误；某酵母菌不能利用废纸，可能的原因是缺乏相应分解酶系（即缺乏纤维素酶和半纤维素酶），D正确。
9．下列对四种微生物相关的叙述，错误的是（ ）
A．CO2和NH3分别是硝化细菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自NH3的氧化
B．CO2和硝酸盐分别是褐藻的碳源和氮源，该生物所需的能源来自太阳能
C．糖类和N2是乳酸菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自乳酸的氧化分解
D．葡萄糖既是酵母菌的碳源也是其能源，但CO2一定不是酵母菌的碳源
【答案】C
【解析】硝化细菌是化能自养需氧型微生物，CO2和NH3分别是硝化细菌的碳源和氮源，该生物所需的能源来自NH3的氧化，A项正确；褐藻能进行光合作用，CO2和硝酸盐分别是褐藻的碳源和氮源，该生物所需的能源来自太阳能，B项正确；乳酸菌是异养厌氧型微生物，乳酸菌不能固氮，因此N2不是其氮源，乳酸是乳酸菌的代谢产物，乳酸菌的碳源为葡萄糖,氮源为无机盐，该生物所需的能源来自糖类的氧化分解，C项错误；酵母菌是异养生物，葡萄糖既是酵母菌的碳源也是其能源，酵母菌不能直接利用CO2，D项正确。
10．筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C（mm）
透明圈直径：H（mm）
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是（ ）
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【答案】C
【解析】培养基一般含有碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等成分，A正确；筛选淀粉分解菌时，需要对菌液进行一系列的梯度稀释，再将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基上进行培养，B正确；由题意可知，以上两种菌均会产生透明圈，说明两种菌均可以产生淀粉酶并分泌到细胞外分解淀粉，C错误；淀粉分解菌的H/C越大，说明其产生的淀粉酶分解的淀粉相对越多，可说明该淀粉分解菌分解淀粉的能力越强，D正确。
11．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法错误的是（ ）
A．倒成平板后直接培养可判断有无污染
B．制备平板时，培养基需先灭菌再倒平板
C．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
D．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
【答案】D
【解析】平板上不含任何生长因子，若倒成平板后直接培养，出现菌落说明已被杂菌感染，因为该嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A正确；制备平板时，先灭菌再倒平板，故倒成平板后不需要进行灭菌处理，B正确；不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，C正确；图中菌落生活在乙丙区域之间，说明同时需要乙和丙，D错误。
12．养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种物质可被硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离与计数”实验中（ ）
A．需要配制添加一定浓度铵盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌
B．应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在火焰旁进行
C．可以采用平板划线法进行接种，还需与未接种的空白培养基同时培养
D．应将培养基置于30 ℃恒温下培养12 h后，统计培养基中全部菌落数
【答案】B
【解析】要分离硝化细菌，应该用以铵盐为唯一氮源的培养基，培养基中不能加入牛肉膏蛋白胨，A错误；获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染，因此，应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在火焰旁进行，B正确；对微生物进行计数时应该采用的接种方法是稀释涂布平板法，C错误；应将培养基置于37℃恒温下培养12 h后，统计菌落数在30—300之间的培养基进行计数，D错误。
二、综合题
13．放线菌是重要的抗生素产生菌，在有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。放线菌产生的抗生素抑菌效果可通过抑菌实验来获得。图一所示为分离和鉴定实验用到的部分仪器。回答下列问题：
（1）分离放线菌时所用的培养基除了含有微生物生长所必需的营养要素外，还要加入10%的酚，该药品的作用是使细菌、霉菌得以淘汰，据此判断该培养基属于___________培养基。
（2）分离采用的方法为________，②可用于______________操作，通过该操作才可在平板上得到单菌落。
（3）举出③在分离时的两个用途：____________、____________。
（4）鉴定放线菌的抑菌效果时，先将分离后经活化的放线菌接种到发酵培养液中，37℃培养3天，将培养液离心，应取离心后的________进行下一步实验。图二中A、B、C分别为涂布有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌悬液的三个平板，图中各放置了六只牛津杯（图一中的④），每个平板右侧三个杯为对照。上述制得的上清液放置的位置为______________，图中抑菌效果最好的是___________组。
【答案】（1）选择
（2）稀释涂布平板法 稀释
（3）对涂布器灭菌 形成无菌区
（4）上清液 牛津杯内 C
【解析】（1）加入10%的酚，淘汰细菌、霉菌，其目的在于筛选所需的放线菌，这类培养基称为选择培养基。
（2）根据实验所采用的实验仪器，它是用于稀释涂布平板法的工具，所以该微生物实验分离采用的方法为稀释涂布平板法。②为定量移液管，可用于稀释操作，通过该操作才可在平板上得到单菌落。
（3）③为酒精灯，在分离时要用于对涂布器灭菌和接种操作时形成一个无菌区，以减少被杂菌污染的机会。
（4）由于发酵液中培养的放线菌会分泌大量抗生素，而抗生素在发酵液中经离心后主要分布在上清液中，所以在鉴定放线菌产生的抗生素效果的实验中，应取离心后的上清液进行鉴定试验。结合图2和题意分析，鉴定试验分三组进行，每组有6个牛津杯分别盛有离心得到的上清液，其中各有3个实验组，三个对照组；对比结果可知，其中C组中有三个实验组得到的抑菌圈（图中白色区域）最大，说明该组的抑菌效果最佳。
14．某种农药M很难降解，对环境会造成一定的污染。为了从土壤中分离出能分解该农药的微生物，某科研人员进行了如图所示的实验。已知含有该农药的培养基呈乳白色，回答下列问题。
（1）该实验所用培养基，从功能上可划分为________培养基，理由是_________________。
（2）该实验过程中，将土壤稀释液接种到培养基表面的常用方法是____________。1g土壤被稀释了__________倍。
（3）根据实验结果_____________（填“能”或“不能”）较为准确的计算出土壤中微生物的数量，理由是_________________________________________。
（4）根据实验结果，可得出的结论是__________________________________。
【答案】（1）鉴定 能分解农药M的微生物和不能分解农药M的微生物均在该培养基上生长，另外能分解农药M的微生物周围会出现透明圈
（2）涂布平板法 105
（3）不能 平板上单菌落数小于30，计数结果误差大
（4）该土壤中有多种能分解农药M的微生物且不同微生物分解农药M的能力有差异
【解析】（1）该实验的目的是要筛选能分解农药M的细菌，所用培养基，从功能上可划分为鉴别培养基，目的是鉴别出能分解农药M的微生物，在分解农药M的微生物产生的菌落周围出现透明圈，而其他的不能分解农药M的微生物菌落周围不会出现透明圈。
（2）该实验过程中，将土壤稀释液接种到培养基表面通常用涂布平板法操作。图中1g土壤首先溶解到99mL无菌水中，随后又稀释了1000倍，故1g土壤被稀释了105倍。
（3）根据实验结果不能较为准确的计算出土壤中微生物的数量，因为图示平板上单菌落数小于30，统计结果误差偏大，在使用稀释涂布平板法计数时，通常选择对应的稀释倍数下涂布的菌落数在30~300范围内的进行计数。
（4）平板上显示了三个大小不同的菌落，且透明圈的大小也各不相同，显然说明是该土壤中有多种能分解农药M的微生物且不同微生物分解农药M的能力有差异。
15．在白酒发酵的窖池中，当培养液的pH≤4.5时，酵母菌的代谢活动逐渐受到抑制，甚至停止。耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种，为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌，研究者进行了相关实验，请回答下列有关问题：
（1）在发酵过程中，窖池中培养液的pH会逐渐下降，原因是_________________________。
（2）取窖底泥，溶于10mL无菌水中，再取1mL 上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养，其目的是_____________________，2天后分别接种到不同酸碱度的麦芽汁培养基上，培养结果见下表。为选择合适的菌种，根据培养结果，可从表格中pH范围为_________的培养基中获得菌种。注：“+”越多表示菌体长得越好
pH=5
pH=4
pH=3
pH=2.5
pH=2
+++++
++++
+++
++
+
（3）通过图示_____________法进行纯化培养，取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，要将涂布器___________后才能进行操作。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3个平板上菌落数分别为99个、92个、94个，则可以推测酵母菌液中每毫升含菌数为_____个。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是_____________。
（4）实验获得了三个耐酸性较强的酵母菌菌株，特点如下表。
菌株
A
B
C
特点
pH≤3.5时，生长代谢正常、优于其它常规菌种
pH≤3.5时，生长代谢正常，pH4～6时不正常
pH2.5～6，生长代谢正常、优于其它常规菌种
依据菌株特点，研究者认为________菌株更适合作为白酒发酵菌株，作出这一判断的理由是____________________________________________________。
【答案】（1）细胞呼吸产生CO2，可形成碳酸，代谢过程还产生了其他酸性物质
（2）使得酵母菌大量繁殖 2-3
（3）稀释涂布平板法 灼烧冷却 9.5×108 有的菌落可能是由2个或多个菌体形成的
（4）C 该菌对pH的耐受范围更大，发酵初期pH近中性，C菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，C菌种依然能正常生长
【解析】（1）在发酵过程中，窖池中培养液的pH会逐渐下降的原因是：酵母菌细胞呼吸产生CO2，可形成碳酸，代谢过程还产生了其他酸性物质。
（2）取窖底泥，溶于10mL无菌水中，再取1mL 上清液接入一定量的麦芽汁培养基中培养，其目的是使得酵母菌大量繁殖；耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种，所以根据培养结果，可从表格中pH范围为2-3的培养基中获得菌种。
（3）图示纯化培养的方法为稀释涂布平板法；在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧冷却后才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了106倍（M），该稀释度下平板上生长的平均菌落数C＝（99＋92＋94）÷3＝95个，涂布平板时所用的稀释液的体积V＝0.1mL，根据公式可知，酵母菌液中每毫升含菌数为（C÷V）×M＝（95÷0.1）×106＝9.5×108个；由于有的菌落可能是由2个或多个菌体形成的，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。
（4）根据表格分析可知，C菌对pH的耐受范围更大，发酵初期pH近中性，C菌种适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，C菌种依然能正常生长，所以C菌株更适合作为白酒发酵菌株。
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