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高考生物一轮复习讲练 第11单元 第37讲 微生物的利用 (含解析)
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这是一份高考生物一轮复习讲练 第11单元 第37讲 微生物的利用 (含解析)，共23页。
第37讲 微生物的利用
[考纲要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(3)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
类型
实例
选择
培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
鉴别
培养基
伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
(4)培养基的制备步骤：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净的培养物。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)常用方法：灭菌和消毒，二者的比较见下表。
项目
条件
结果
常用方法
应用举例
消毒
较为温和的物理或化学方法
杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
3.大肠杆菌的纯化培养
(1)原理：在培养基上将聚集的菌种稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
(2)两种微生物纯化培养的方法比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
平板示意图
纯化原理
通过连续划线操作实现
将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的菌落特征获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
(3)菌种的保藏方法
①临时保藏法：对于频繁使用的菌种，先将菌种接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后将试管放入4 ℃的冰箱中保藏。
②甘油管藏法：对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，充分混匀后放在－20 ℃冷冻箱中保存。
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(4)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落
( √ )
易错警示 (1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)划线时最后一区的划线不要与第一区相连。
(3)划线时用力大小要适当，这是为了防止用力过大将培养基划破。
(4)用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
考向一 微生物的培养和无菌技术分析
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．微生物的培养基
营养要素
来源
功能
碳源
无机碳源
CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物
①构成细胞物质和一些代谢产物；
②既是碳源又是能源(有机碳源)
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源
无机氮源
NH3、铵盐、硝酸盐、N2等
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸
特殊营养物质
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应
3.稀释涂布平板的操作过程
(1)系列稀释：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应离火焰1～2 cm处。操作过程如下：
(2)涂布平板
序号
图示
操作
1
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
2
取少量菌液(不超过0.1 mL)，滴加到培养基表面
3
将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s
4
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀
1．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________________。在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。
答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
解析 (1)干热灭菌是指将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃加热1～2 h。耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。
(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。
(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。
(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。
(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
2．牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答：
(1)图中步骤①称为__________消毒法。步骤②是______________。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供______________________。进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具？______________。为了避免杂菌污染，此步骤应在__________________附近进行。
(3)将接种后的培养基和作为对照的____________________同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养36小时。取出后统计各平板的菌落数，结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为________的平板进行计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是____________/mL。
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
答案 (1)巴氏 系列稀释(或梯度稀释) (2)碳源、氮源(和维生素) B 酒精灯火焰 (3)一个未接种的培养基 102 85 000个
解析 (1)80 ℃恒温水浴锅煮15 min是巴氏消毒法，步骤②是进行系列稀释(或梯度稀释)。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源(和维生素)，③是接种，因为需要计数，需用稀释涂布平板法，接种工具是涂布器；为了避免杂菌污染，此步骤应在酒精灯火焰附近进行。(3)统计各平板的菌落数时，应选择菌落数在30～300的计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是(87＋83＋85)÷3÷0.1×102＝85 000(个)。
考向二 微生物的纯化方法及过程分析
如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？
提示 获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？
提示 酒精灯火焰附近存在着无菌区域。
3．(2018·全国Ⅲ，37)回答下列与酵母菌有关的问题：
(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是____________________________________________。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是________________________________。
答案 (1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 (2)菌体快速增殖 乙醇产生 (3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为酵母菌的繁殖提供能量；在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。
(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌分解葡萄糖产生大量的CO2，CO2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。
4．下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。
成分
含量
蛋白胨
10.0 g
乳糖
5.0 g
蔗糖
5.0 g
K2HPO4
2.0 g
显色剂(伊红美蓝)
0.2 g
琼脂
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)根据用途划分，该培养基属于________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是_________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是_________。
(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为____________。
(3)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如图，推测该同学接种时可能的操作失误是______________________________。
答案 (1)鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红指示剂 (2)异养型 (3)涂布不均匀
解析 (1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型。(3)由题图可知，该同学接种时采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好地分散开来，可能是涂布不均匀导致的。
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。样品的稀释和稀释液的取样培养流程如下。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积)×稀释倍数。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。
(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②原理
纤维素纤维二糖葡萄糖
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
纤维素分解菌
↓
→红色复合物红色消失，出现透明圈。
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( × )
(2)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法，也能用平板划线法( × )
(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( √ )
(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( × )
(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
( × )
易错警示 尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
考向一 选择培养基成分及配制方法的分析
5．(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有___________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是____________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析 (1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。
(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。
(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖，淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。
(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中， 1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
6．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基____________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用__________________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于___________。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_____________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。
答案 (1)苯酚 影响 稀释涂布平板 (2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作
解析 (1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用稀释涂布平板法来测定②中活菌数量。(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程都要进行无菌操作。无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
考向二 微生物分离与计数的实例分析
1．统计菌落数目的两种方法
(1)显微镜直接计数法
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量
方法
用计数板计数
缺点
不能区分死菌与活菌而使计数结果偏大
(2)间接计数法(活菌计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，计算样品中的活菌数
计算公式
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数
操作
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计结果可能偏小
2.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择
培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定
培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现易于区分的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂
鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色
鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
7．从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：
回答下列问题：
(1)在过程④的选择培养基是________(填“固体”或“液体”)培养基，过程⑧的选择培养基是________(填“固体”或“液体”)培养基。过程④的具体操作是______________________；过程⑧的具体操作是_____________________________________________________________。
(2)在过程③样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为________________________。
(3)过程⑩采用__________________________的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是__________________________________________。
答案 (1)固体 液体 以尿素为唯一氮源 以纤维素为唯一碳源 (2)稀释涂布平板法
(3)倒平板时加入刚果红染液 不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈
解析 (1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程④的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程⑧所示的选择培养，因此过程⑧的选择培养基是液体培养基。过程④选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；过程⑧选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以具体的操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板法，将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程⑩采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。
8．水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以________________作为唯一碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显__________(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用_______计数板直接计数。若将100 mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中有PVA分解菌____________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________用于鉴别PVA分解菌。要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定_________________来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
答案 (1)聚乙烯醇(或PVA) 多于 (2)血细胞 1.6×109 偏小 (3)碘 白色透明斑的大小(或直径)
解析 (1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以聚乙烯醇(PVA)作为唯一碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。根据题意，100 mL原菌液中有PVA分解菌的数量为160÷0.1×104×100＝1.6×109(个)。由于该方法得到的菌落可能是两个或者多个细菌共同产生的一个菌落，导致统计的菌落数较实际菌落数偏少，所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
1．无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒方法包括煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法和紫外线消毒法等；灭菌方法包括灼烧灭菌法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法等。
2．培养基的制备包括计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。
3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分稀释。
4．微生物的计数要求制作多个平板，且选择能长出30～300个菌落的平板进行计数。
5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
1．(2019·江苏，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是( )
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
答案 A
解析 培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后，接种环灼烧可以防止微生物扩散，污染接种室或者超净台，影响整体接种环境，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数都可以使用固体培养基，D正确。
2．(2019·江苏，19)下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，错误的是( )
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
答案 A
解析 产纤维素酶菌能利用纤维素，故筛选培养基应以纤维素作为唯一碳源，A项错误；富含腐殖质的林下土壤中含有较多的能分解纤维素的产纤维素酶菌，B项正确；用筛选培养基分离得到的菌落只是初步筛选，还需进一步确定其产纤维素酶的能力，C项正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，动物食用后更容易消化吸收，故可提高其饲用价值，D项正确。
3．(2019·北京，3)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C(mm)
透明圈直径：H(mm)
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是( )
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
答案 C
解析 微生物培养基一般都含有四类营养物质：水、无机盐、碳源和氮源，A项正确；常用稀释涂布平板法筛选淀粉分解菌，涂布前需将菌液稀释，B项正确；由题图可知，细菌Ⅰ和细菌Ⅱ形成的菌落周围都出现了透明圈，说明两种细菌都能将淀粉酶分泌至细胞外，C项错误；淀粉分解菌可分解淀粉，导致菌落周围的淀粉被分解，不能与稀碘液反应生成蓝色，故而出现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明细菌分解淀粉能力越强，D项正确。
4．(2019·全国Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择______菌落进一步纯化，选择的依据是________________
_______________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________________________。
答案 (1)W (2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W (3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 (4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
解析 (1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
5．(2019·全国Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题：
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是______________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和__________________。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 X (2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 (3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
6．(2019·全国Ⅲ，37)回答下列与细菌培养相关的问题：
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是______________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_________________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过__________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
答案 (1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 (2)倒置 (3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 (4)灭菌
解析 (1)蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以利用空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水滴落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
一、选择题
1．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，下列相关叙述正确的是( )
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，只能通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
答案 B
解析 生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；在涂布平板上长出的菌落，可以通过平板划线法或稀释涂布平板法进一步纯化，C错误；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
2. 下列关于“微生物的分离与培养”实验的叙述，正确的是( )
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．培养基灭菌后，需冷却至60 ℃左右时倒平板
C．为了防止污染，接种环经火焰灼烧后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
答案 D
解析 高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时倒平板，B错误；接种环经火焰灼烧灭菌后，应在火焰旁冷却后再用其挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。
3．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)，实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源
B．实验培养过程中进行振荡培养的主要目的是增大目的菌的浓度
C．实验操作过程中，要注意防止外来杂菌污染
D．将从固体培养基上得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种纯化
答案 B
解析 磷酸盐、镁盐以及一些微量元素中不含有C、N元素，由此可推测该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源，A正确；实验培养过程中进行振荡培养可以增加培养液中的溶氧量，满足微生物对氧气的需求，B错误；筛选微生物的过程中应注意防止外来杂菌污染，C正确；在以化合物A为唯一碳源的培养基中只有能降解化合物A的微生物才能生长繁殖，不能利用化合物A的微生物因缺乏碳源和氮源，无法生长繁殖，将从固体培养基上得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种“纯化”，D正确。
4．某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中，正确的是( )
A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B．利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数
C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验
D．培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源
答案 D
解析 实验用过的带菌培养基要高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，A项错误；应利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数，B项错误；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，C项错误；培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和碳源，D项正确。
5．下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，正确的是( )
A．第一次测定某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养
B．一般选用103～107倍的稀释液分别涂布
C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
D．统计菌落数目时，稀释涂布平板法需要设置重复组
答案 D
解析 在土壤中，细菌的数量比真菌多，所以为了确保稀释后能形成菌落数在30～300之间的培养皿，在进行分离与计数时，就需要按照不同的稀释度分别进行涂布，测定细菌一般选择104、105、106倍稀释，测定放线菌一般选择103、104、105倍稀释，测定真菌一般选择102、103、104倍稀释，而首次测定某种细菌数量时，可将范围放宽点，将103～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，A、B、C错误；统计菌落数目时，稀释涂布平板法需要设置重复组，以增强实验的说服力与准确性，D正确。
6．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是( )
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照
C．将实验组和对照组平板倒置，25 ℃恒温培养24～48小时
D．选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数
答案 C
解析 利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度，稀释倍数太低，菌落太多会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不易进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，B正确；将实验组和对照组平板倒置，30～37 ℃恒温培养24～48小时，C错误；计数时通常选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数，D正确。
二、非选择题
7．幽门螺旋杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素，据研究发现，目前我国有超过50%的人感染了Hp病菌。Hp是微需氧菌，环境氧要求5%～8%，在大气或绝对厌氧环境下均能生长，Hp中某种酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下生存。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
配制培养基→灭菌、倒平板→X→培养→观察
请回答：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有____________________，所以它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。
(2)步骤X的操作如图所示：
①微生物接种的方法有很多，但都要注意_______________；上图所示方法为______________。
②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是_________________。
(3)在培养时，需将培养皿______并放在恒温培养箱中。
答案 (1)催化尿素水解成氨的酶 红 (2)①防止外来杂菌的入侵 稀释涂布平板法 ②使微生物和无菌水混合均匀 (3)倒置
解析 (1)由于幽门螺旋杆菌含有能将尿素分解成氨的酶，而氨会使培养基碱性增强，即pH升高，导致酚红指示剂变红。
(2)①微生物接种的方法有很多，但都要注意防止外来杂菌的入侵。接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法题。题图为稀释涂布平板法。②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。
(3)培养时需将培养皿倒置并放在恒温箱中培养，倒置培养的目的是防止皿盖上冷凝的水珠滴在培养基中污染培养基。
8．某研究小组对自来水和污染河水水样中的大肠杆菌含量进行了测定。回答下列问题：
(1)检测自来水中大肠杆菌的数量，可选用伊红美蓝培养基。该培养基除了为大肠杆菌的生长、繁殖提供水和氮源外，还要提供________________(答出两点)等基本营养成分；制备该培养基时应在灭菌之________(填“前”或“后”)调整pH至7.6，以满足大肠杆菌生长的要求；该培养基中加入伊红美蓝的作用是________________________________________________。
(2)研究小组使用“滤膜法”对污染严重的河流水体进行大肠杆菌活菌数的测定，需将水样进行适当稀释，如取水样1 mL加入____________mL制备稀释倍数为10倍的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液。取每个稀释倍数的菌液5 mL进行过滤，然后将滤膜放置在伊红美蓝培养基上培养。如果经过培养后，稀释倍数为103对应的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48个，那么每升河水约含大肠杆菌______________个。
(3)用上述方法统计样本中菌落数时需要设置对照组。若在调查中，某一实验组平板上菌落平均数为46个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，请分析说明空白对照组出现菌落的可能原因：__________________________(答出三点即可)。若将40(即46－6)个/平板作为实验组菌落数的平均值进行计算，则该做法____________(填“正确”或“不正确”)。
答案 (1)碳源和无机盐 前 使大肠杆菌的菌落呈现黑色，便于对大肠杆菌计数
(2)无菌水9 9×106
(3)培养基灭菌不合格、倒平板过程被污染、培养皿灭菌不合格等 不正确
解答 (1)微生物培养基成分应包括水、无机盐、碳源、氮源等，伊红美蓝培养基在功能上属于鉴别培养基。制备该培养基时应在灭菌之前调整pH至7.6，以满足大肠杆菌生长的要求；该培养基中加入伊红美蓝的作用是使大肠杆菌的菌落呈现黑色，便于对大肠杆菌计数。
(2)使用“滤膜法”对污染严重的河流水体进行大肠杆菌活菌数的测定，需将水样进行适当稀释，如取水样1 mL加入无菌水9 mL制备稀释倍数为10倍的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液。取每个稀释倍数的菌液5 mL进行过滤，然后将滤膜放置在伊红美蓝培养基上培养。如果经过培养后，稀释倍数为103对应的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48个，那么每升河水约含大肠杆菌(43＋47＋42＋48)÷4÷5×103×103＝9×106(个)。
(3)若在调查中，某一实验组平板上菌落平均数为46个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，则空白对照组出现菌落的可能原因：培养基灭菌不合格、倒平板过程被污染、培养皿灭菌不合格等；若将40(即46－6)个/平板作为实验组菌落数的平均值进行计算，则该做法不正确，因为在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落，若出现菌落，说明操作过程中存在微生物污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。
9．(2020·芜湖模拟)如图是某课题小组设计的“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验流程示意图。回答下列问题：
(1)微生物接种的方法有很多，该图所示为______________________法，这一方法常用来统计样品中__________(填“活菌”“死菌”或“活菌和死菌”)的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数在__________的平板进行计数。
(2)实验过程中，需对培养基进行灭菌，常用的方法是________________________。接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止____________________。
(3)对分离得到的分解尿素的细菌作进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养。其鉴定原理是_______________________________________。
答案 (1)稀释涂布平板 活菌 30～300 (2)高压蒸汽灭菌法 杂菌污染 (3)分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，指示剂变红
解析 (1)微生物接种的方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，该图所示为稀释涂布平板法，这一方法常用来统计样品中活菌的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)常见的灭菌方法有：灼烧灭菌法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法，实验过程中，需对培养基进行灭菌，常用的方法是高压蒸汽灭菌法。接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止杂菌污染。
(3)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。对分离得到的分解尿素的细菌作进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养。其鉴定原理是分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，指示剂变红。
10．现在国家大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。下图是工业上利用微生物分解纤维素生产乙醇的基本工艺流程。请回答相关问题：
(1)将从土壤中获得的微生物培养在以________为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，为了得到单一菌落，常采用的接种方法有两种，即________________和_________________。
(2)若①环节选择霉烂的木头，则②环节获得的酶中至少包括C1酶、____________和______________三种组分，其中能够将纤维二糖分解为葡萄糖的是____________。
(3)在含纤维素的培养基中通常加入____________染液，此染液可与纤维素形成________色复合物。用含有此染料的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。我们可以通过此方法来筛选纤维素分解菌。
答案 (1)纤维素 平板划线法 稀释涂布平板法
(2)CX酶 葡萄糖苷酶 葡萄糖苷酶 (3)刚果红 红 透明圈
解析 (1)要从土壤中获得能分解纤维素的微生物，需要将土壤中获得的微生物培养在以纤维素为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(2)②环节获得的酶为纤维素酶，是由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分组成的复合酶，其中C1酶、CX酶可将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。(3)在培养基中加入刚果红染液，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
第37讲 微生物的利用
[考纲要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(3)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
类型
实例
选择
培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
鉴别
培养基
伊红美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
(4)培养基的制备步骤：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净的培养物。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)常用方法：灭菌和消毒，二者的比较见下表。
项目
条件
结果
常用方法
应用举例
消毒
较为温和的物理或化学方法
杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器
3.大肠杆菌的纯化培养
(1)原理：在培养基上将聚集的菌种稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
(2)两种微生物纯化培养的方法比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
平板示意图
纯化原理
通过连续划线操作实现
将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可以根据菌落的菌落特征获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
(3)菌种的保藏方法
①临时保藏法：对于频繁使用的菌种，先将菌种接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后将试管放入4 ℃的冰箱中保藏。
②甘油管藏法：对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，充分混匀后放在－20 ℃冷冻箱中保存。
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(4)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落
( √ )
易错警示 (1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)划线时最后一区的划线不要与第一区相连。
(3)划线时用力大小要适当，这是为了防止用力过大将培养基划破。
(4)用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
考向一 微生物的培养和无菌技术分析
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．微生物的培养基
营养要素
来源
功能
碳源
无机碳源
CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物
①构成细胞物质和一些代谢产物；
②既是碳源又是能源(有机碳源)
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源
无机氮源
NH3、铵盐、硝酸盐、N2等
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸
特殊营养物质
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应
3.稀释涂布平板的操作过程
(1)系列稀释：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应离火焰1～2 cm处。操作过程如下：
(2)涂布平板
序号
图示
操作
1
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
2
取少量菌液(不超过0.1 mL)，滴加到培养基表面
3
将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s
4
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀
1．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________________。在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。
答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
解析 (1)干热灭菌是指将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃加热1～2 h。耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。
(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。
(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。
(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。
(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
2．牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30 000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。分析回答：
(1)图中步骤①称为__________消毒法。步骤②是______________。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供______________________。进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具？______________。为了避免杂菌污染，此步骤应在__________________附近进行。
(3)将接种后的培养基和作为对照的____________________同时放入37 ℃恒温培养箱中，培养36小时。取出后统计各平板的菌落数，结果如下表所示。应该选择其中稀释倍数为________的平板进行计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是____________/mL。
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
答案 (1)巴氏 系列稀释(或梯度稀释) (2)碳源、氮源(和维生素) B 酒精灯火焰 (3)一个未接种的培养基 102 85 000个
解析 (1)80 ℃恒温水浴锅煮15 min是巴氏消毒法，步骤②是进行系列稀释(或梯度稀释)。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源(和维生素)，③是接种，因为需要计数，需用稀释涂布平板法，接种工具是涂布器；为了避免杂菌污染，此步骤应在酒精灯火焰附近进行。(3)统计各平板的菌落数时，应选择菌落数在30～300的计数，经过消毒后的牛奶中，细菌数大约是(87＋83＋85)÷3÷0.1×102＝85 000(个)。
考向二 微生物的纯化方法及过程分析
如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？
提示 获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？
提示 酒精灯火焰附近存在着无菌区域。
3．(2018·全国Ⅲ，37)回答下列与酵母菌有关的问题：
(1)分离培养酵母菌通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是____________________________________________。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是________________________________。
答案 (1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 (2)菌体快速增殖 乙醇产生 (3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为酵母菌的繁殖提供能量；在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。
(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌分解葡萄糖产生大量的CO2，CO2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。
4．下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。
成分
含量
蛋白胨
10.0 g
乳糖
5.0 g
蔗糖
5.0 g
K2HPO4
2.0 g
显色剂(伊红美蓝)
0.2 g
琼脂
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)根据用途划分，该培养基属于________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是_________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是_________。
(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为____________。
(3)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如图，推测该同学接种时可能的操作失误是______________________________。
答案 (1)鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红指示剂 (2)异养型 (3)涂布不均匀
解析 (1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型。(3)由题图可知，该同学接种时采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好地分散开来，可能是涂布不均匀导致的。
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。样品的稀释和稀释液的取样培养流程如下。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积)×稀释倍数。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。
(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
②原理
纤维素纤维二糖葡萄糖
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
纤维素分解菌
↓
→红色复合物红色消失，出现透明圈。
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释：制备系列稀释液
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( × )
(2)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法，也能用平板划线法( × )
(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( √ )
(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( × )
(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
( × )
易错警示 尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
考向一 选择培养基成分及配制方法的分析
5．(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有___________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是____________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________
_______________________________________________________________________________。
答案 (1)细菌 选择 (2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 (4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析 (1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。
(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。
(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖，淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。
(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中， 1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
6．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请据图回答下列问题：
(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基____________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用__________________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于___________。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_____________________________________。
(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
________________________________________________________________________。
答案 (1)苯酚 影响 稀释涂布平板 (2)④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作
解析 (1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以②中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用稀释涂布平板法来测定②中活菌数量。(2)④与⑤培养基的主要区别在于④的培养基中没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基中加入了苯酚作为碳源；采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程都要进行无菌操作。无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
考向二 微生物分离与计数的实例分析
1．统计菌落数目的两种方法
(1)显微镜直接计数法
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的样品中微生物的数量
方法
用计数板计数
缺点
不能区分死菌与活菌而使计数结果偏大
(2)间接计数法(活菌计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，计算样品中的活菌数
计算公式
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数
操作
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计结果可能偏小
2.微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择
培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定
培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现易于区分的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂
鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色
鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
7．从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：
回答下列问题：
(1)在过程④的选择培养基是________(填“固体”或“液体”)培养基，过程⑧的选择培养基是________(填“固体”或“液体”)培养基。过程④的具体操作是______________________；过程⑧的具体操作是_____________________________________________________________。
(2)在过程③样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为________________________。
(3)过程⑩采用__________________________的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是__________________________________________。
答案 (1)固体 液体 以尿素为唯一氮源 以纤维素为唯一碳源 (2)稀释涂布平板法
(3)倒平板时加入刚果红染液 不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈
解析 (1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程④的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程⑧所示的选择培养，因此过程⑧的选择培养基是液体培养基。过程④选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；过程⑧选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以具体的操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板法，将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程⑩采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。
8．水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以________________作为唯一碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显__________(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用_______计数板直接计数。若将100 mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中有PVA分解菌____________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________用于鉴别PVA分解菌。要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定_________________来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
答案 (1)聚乙烯醇(或PVA) 多于 (2)血细胞 1.6×109 偏小 (3)碘 白色透明斑的大小(或直径)
解析 (1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以聚乙烯醇(PVA)作为唯一碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。根据题意，100 mL原菌液中有PVA分解菌的数量为160÷0.1×104×100＝1.6×109(个)。由于该方法得到的菌落可能是两个或者多个细菌共同产生的一个菌落，导致统计的菌落数较实际菌落数偏少，所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
1．无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒方法包括煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法和紫外线消毒法等；灭菌方法包括灼烧灭菌法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法等。
2．培养基的制备包括计算、称量、溶化、调pH、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。
3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分稀释。
4．微生物的计数要求制作多个平板，且选择能长出30～300个菌落的平板进行计数。
5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
1．(2019·江苏，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是( )
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
答案 A
解析 培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后，接种环灼烧可以防止微生物扩散，污染接种室或者超净台，影响整体接种环境，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数都可以使用固体培养基，D正确。
2．(2019·江苏，19)下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，错误的是( )
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
答案 A
解析 产纤维素酶菌能利用纤维素，故筛选培养基应以纤维素作为唯一碳源，A项错误；富含腐殖质的林下土壤中含有较多的能分解纤维素的产纤维素酶菌，B项正确；用筛选培养基分离得到的菌落只是初步筛选，还需进一步确定其产纤维素酶的能力，C项正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，动物食用后更容易消化吸收，故可提高其饲用价值，D项正确。
3．(2019·北京，3)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C(mm)
透明圈直径：H(mm)
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是( )
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
答案 C
解析 微生物培养基一般都含有四类营养物质：水、无机盐、碳源和氮源，A项正确；常用稀释涂布平板法筛选淀粉分解菌，涂布前需将菌液稀释，B项正确；由题图可知，细菌Ⅰ和细菌Ⅱ形成的菌落周围都出现了透明圈，说明两种细菌都能将淀粉酶分泌至细胞外，C项错误；淀粉分解菌可分解淀粉，导致菌落周围的淀粉被分解，不能与稀碘液反应生成蓝色，故而出现透明圈，透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明细菌分解淀粉能力越强，D项正确。
4．(2019·全国Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择______菌落进一步纯化，选择的依据是________________
_______________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明_________________________________________。
答案 (1)W (2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W (3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 (4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
解析 (1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
5．(2019·全国Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题：
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是______________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和__________________。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 X (2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 (3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
6．(2019·全国Ⅲ，37)回答下列与细菌培养相关的问题：
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是______________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_________________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过__________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
答案 (1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 (2)倒置 (3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 (4)灭菌
解析 (1)蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以利用空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水滴落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
一、选择题
1．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，下列相关叙述正确的是( )
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，只能通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
答案 B
解析 生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，从而获得漆酶菌株，B正确；在涂布平板上长出的菌落，可以通过平板划线法或稀释涂布平板法进一步纯化，C错误；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
2. 下列关于“微生物的分离与培养”实验的叙述，正确的是( )
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．培养基灭菌后，需冷却至60 ℃左右时倒平板
C．为了防止污染，接种环经火焰灼烧后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
答案 D
解析 高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时倒平板，B错误；接种环经火焰灼烧灭菌后，应在火焰旁冷却后再用其挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。
3．某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及一些微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)，实验的主要步骤如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A．该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源
B．实验培养过程中进行振荡培养的主要目的是增大目的菌的浓度
C．实验操作过程中，要注意防止外来杂菌污染
D．将从固体培养基上得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种纯化
答案 B
解析 磷酸盐、镁盐以及一些微量元素中不含有C、N元素，由此可推测该培养基中化合物A可能既作碳源又作氮源，A正确；实验培养过程中进行振荡培养可以增加培养液中的溶氧量，满足微生物对氧气的需求，B错误；筛选微生物的过程中应注意防止外来杂菌污染，C正确；在以化合物A为唯一碳源的培养基中只有能降解化合物A的微生物才能生长繁殖，不能利用化合物A的微生物因缺乏碳源和氮源，无法生长繁殖，将从固体培养基上得到的目的菌重复多次上述实验的目的是对菌种“纯化”，D正确。
4．某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述中，正确的是( )
A．实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉
B．利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数
C．观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验
D．培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为细菌培养提供氮源和碳源
答案 D
解析 实验用过的带菌培养基要高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，A项错误；应利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数，B项错误；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，C项错误；培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和碳源，D项正确。
5．下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，正确的是( )
A．第一次测定某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养
B．一般选用103～107倍的稀释液分别涂布
C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
D．统计菌落数目时，稀释涂布平板法需要设置重复组
答案 D
解析 在土壤中，细菌的数量比真菌多，所以为了确保稀释后能形成菌落数在30～300之间的培养皿，在进行分离与计数时，就需要按照不同的稀释度分别进行涂布，测定细菌一般选择104、105、106倍稀释，测定放线菌一般选择103、104、105倍稀释，测定真菌一般选择102、103、104倍稀释，而首次测定某种细菌数量时，可将范围放宽点，将103～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，A、B、C错误；统计菌落数目时，稀释涂布平板法需要设置重复组，以增强实验的说服力与准确性，D正确。
6．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是( )
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作对照
C．将实验组和对照组平板倒置，25 ℃恒温培养24～48小时
D．选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数
答案 C
解析 利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释度，稀释倍数太低，菌落太多会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不易进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基作对照，B正确；将实验组和对照组平板倒置，30～37 ℃恒温培养24～48小时，C错误；计数时通常选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数，D正确。
二、非选择题
7．幽门螺旋杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素，据研究发现，目前我国有超过50%的人感染了Hp病菌。Hp是微需氧菌，环境氧要求5%～8%，在大气或绝对厌氧环境下均能生长，Hp中某种酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下生存。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
配制培养基→灭菌、倒平板→X→培养→观察
请回答：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有____________________，所以它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。
(2)步骤X的操作如图所示：
①微生物接种的方法有很多，但都要注意_______________；上图所示方法为______________。
②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是_________________。
(3)在培养时，需将培养皿______并放在恒温培养箱中。
答案 (1)催化尿素水解成氨的酶 红 (2)①防止外来杂菌的入侵 稀释涂布平板法 ②使微生物和无菌水混合均匀 (3)倒置
解析 (1)由于幽门螺旋杆菌含有能将尿素分解成氨的酶，而氨会使培养基碱性增强，即pH升高，导致酚红指示剂变红。
(2)①微生物接种的方法有很多，但都要注意防止外来杂菌的入侵。接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法题。题图为稀释涂布平板法。②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。
(3)培养时需将培养皿倒置并放在恒温箱中培养，倒置培养的目的是防止皿盖上冷凝的水珠滴在培养基中污染培养基。
8．某研究小组对自来水和污染河水水样中的大肠杆菌含量进行了测定。回答下列问题：
(1)检测自来水中大肠杆菌的数量，可选用伊红美蓝培养基。该培养基除了为大肠杆菌的生长、繁殖提供水和氮源外，还要提供________________(答出两点)等基本营养成分；制备该培养基时应在灭菌之________(填“前”或“后”)调整pH至7.6，以满足大肠杆菌生长的要求；该培养基中加入伊红美蓝的作用是________________________________________________。
(2)研究小组使用“滤膜法”对污染严重的河流水体进行大肠杆菌活菌数的测定，需将水样进行适当稀释，如取水样1 mL加入____________mL制备稀释倍数为10倍的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液。取每个稀释倍数的菌液5 mL进行过滤，然后将滤膜放置在伊红美蓝培养基上培养。如果经过培养后，稀释倍数为103对应的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48个，那么每升河水约含大肠杆菌______________个。
(3)用上述方法统计样本中菌落数时需要设置对照组。若在调查中，某一实验组平板上菌落平均数为46个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，请分析说明空白对照组出现菌落的可能原因：__________________________(答出三点即可)。若将40(即46－6)个/平板作为实验组菌落数的平均值进行计算，则该做法____________(填“正确”或“不正确”)。
答案 (1)碳源和无机盐 前 使大肠杆菌的菌落呈现黑色，便于对大肠杆菌计数
(2)无菌水9 9×106
(3)培养基灭菌不合格、倒平板过程被污染、培养皿灭菌不合格等 不正确
解答 (1)微生物培养基成分应包括水、无机盐、碳源、氮源等，伊红美蓝培养基在功能上属于鉴别培养基。制备该培养基时应在灭菌之前调整pH至7.6，以满足大肠杆菌生长的要求；该培养基中加入伊红美蓝的作用是使大肠杆菌的菌落呈现黑色，便于对大肠杆菌计数。
(2)使用“滤膜法”对污染严重的河流水体进行大肠杆菌活菌数的测定，需将水样进行适当稀释，如取水样1 mL加入无菌水9 mL制备稀释倍数为10倍的稀释液，并照此依次制备更高倍数的稀释液。取每个稀释倍数的菌液5 mL进行过滤，然后将滤膜放置在伊红美蓝培养基上培养。如果经过培养后，稀释倍数为103对应的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48个，那么每升河水约含大肠杆菌(43＋47＋42＋48)÷4÷5×103×103＝9×106(个)。
(3)若在调查中，某一实验组平板上菌落平均数为46个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，则空白对照组出现菌落的可能原因：培养基灭菌不合格、倒平板过程被污染、培养皿灭菌不合格等；若将40(即46－6)个/平板作为实验组菌落数的平均值进行计算，则该做法不正确，因为在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落，若出现菌落，说明操作过程中存在微生物污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。
9．(2020·芜湖模拟)如图是某课题小组设计的“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验流程示意图。回答下列问题：
(1)微生物接种的方法有很多，该图所示为______________________法，这一方法常用来统计样品中__________(填“活菌”“死菌”或“活菌和死菌”)的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数在__________的平板进行计数。
(2)实验过程中，需对培养基进行灭菌，常用的方法是________________________。接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止____________________。
(3)对分离得到的分解尿素的细菌作进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养。其鉴定原理是_______________________________________。
答案 (1)稀释涂布平板 活菌 30～300 (2)高压蒸汽灭菌法 杂菌污染 (3)分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，指示剂变红
解析 (1)微生物接种的方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，该图所示为稀释涂布平板法，这一方法常用来统计样品中活菌的数目。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
(2)常见的灭菌方法有：灼烧灭菌法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法，实验过程中，需对培养基进行灭菌，常用的方法是高压蒸汽灭菌法。接种操作都应在酒精灯火焰附近进行，目的是防止杂菌污染。
(3)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。对分离得到的分解尿素的细菌作进一步鉴定时，可在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂进行细菌培养。其鉴定原理是分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，指示剂变红。
10．现在国家大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。下图是工业上利用微生物分解纤维素生产乙醇的基本工艺流程。请回答相关问题：
(1)将从土壤中获得的微生物培养在以________为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，为了得到单一菌落，常采用的接种方法有两种，即________________和_________________。
(2)若①环节选择霉烂的木头，则②环节获得的酶中至少包括C1酶、____________和______________三种组分，其中能够将纤维二糖分解为葡萄糖的是____________。
(3)在含纤维素的培养基中通常加入____________染液，此染液可与纤维素形成________色复合物。用含有此染料的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。我们可以通过此方法来筛选纤维素分解菌。
答案 (1)纤维素 平板划线法 稀释涂布平板法
(2)CX酶 葡萄糖苷酶 葡萄糖苷酶 (3)刚果红 红 透明圈
解析 (1)要从土壤中获得能分解纤维素的微生物，需要将土壤中获得的微生物培养在以纤维素为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(2)②环节获得的酶为纤维素酶，是由C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分组成的复合酶，其中C1酶、CX酶可将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。(3)在培养基中加入刚果红染液，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
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