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高中生物高考2022年高考生物一轮复习 第11单元 第37讲 微生物的利用
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这是一份高中生物高考2022年高考生物一轮复习 第11单元 第37讲 微生物的利用，共26页。
第37讲 微生物的利用
[目标要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。
考点一 微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净培养物。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)常用方法：灭菌和消毒。
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)
教材中的隐性知识 源于选修1 P85附录4“高压灭菌的操作方法”
(1)灭菌桶装入待灭菌物品不要装太挤的原因是避免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
(2)加热灭菌锅时应打开排气阀，目的是排除锅内冷空气，之后，才能关上排气阀。
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)计算
↓
(2)称量
↓
(3)溶化
↓
(4)灭菌
↓
(5)倒平板
4．纯化培养
(1)方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(2)菌落的概念：由单个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(3)平板划线法分离纯化大肠杆菌
①
接种
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，在摇床上37 ℃下振荡培养12 h
②
划线
分离
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中沾取菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿
③
培养
观察
将培养皿倒置，放在37 ℃恒温箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落
(4)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
教材中的隐性知识 源于选修1 P18“旁栏小资料”
(1)微生物的接种方法除平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。
(2)微生物接种的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
5．菌种的保藏方法
主要方法
临时保藏法
甘油管藏法
保藏对象
频繁使用的菌种
长期保藏的菌种
方法步骤
先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4 ℃的冰箱中
转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20 ℃冷冻箱中保存
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)由于物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型( × )
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(4)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌( × )
(5)配制培养基时应先灭菌再调pH( × )
(6)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧( √ )
(7)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
(8)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落
( √ )
(9)斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株( × )
(10)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( × )
源于选修1 P17～18讨论
(1)平板冷凝后，要将平板倒置，原因是可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。
(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物，原因是空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
(3)平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
项目
选择培养基
鉴别培养基
制备方法
培养基中加入某些化学物质
培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计
产生特定的颜色或其他变化
用途
从众多微生物中分离出所需的微生物
鉴别不同种类的微生物
2.消毒和灭菌的辨析
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器的灭菌
3.两种纯化方法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离结果
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种用具
接种环
涂布器
注意事项
(1)接种环的灼烧：①第一次划线前，避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；②再次划线前，杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种直接来源于上次划线的末端；③划线结束后，杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(2)接种环灼烧后，要冷却后才能接触菌液，以免温度太高杀死菌种。
(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破
(1)在进行稀释操作时，每支试管及其中的9 mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时：①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时要让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何其他物体
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
考向一 培养基与无菌技术
1．(2019·安徽定远一模)下表所示是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题：
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
显色剂(伊红美蓝)
琼脂
含量
10.0 g
5.0 g
5.0 g
2.0 g
0.2 g
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)根据用途划分，该培养基属于____________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基作出的最关键的调整是____________________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是________________________。
(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为____________。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？
________________________________________________________________________。
答案 (1)鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红 (2)异养型 不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存
解析 (1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存，因此该培养基不能分离筛选出大肠杆菌。
2．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________________。在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。
答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气
(5)未将锅内冷空气排尽
考向二 微生物的培养
3．下列有关“微生物的分离与培养”实验的叙述正确的是( )
A．高压蒸汽灭菌锅加盖时应按顺时针方向依次旋紧每一个螺栓
B．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类
C．对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记
D．利用平板划线法可对微生物进行接种、纯化、分离和计数
答案 C
4．(2020·汕头质检)某生物兴趣小组的同学计划调查某快餐店的冰块中大肠杆菌的含量。具体实验步骤如下：
第一步：配制培养基(成分：蛋白胨、氯化钠、乳糖、水、X和Y)。
第二步：制作无菌平板(含成分Y)。
第三步：设置空白对照组和实验组，对照组接种①，实验组接种②。
第四步：将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)培养基中的乳糖可以为大肠杆菌提供____________。为了方便大肠杆菌的鉴定，需要在培养基中添加成分X______________，在该培养基表面，大肠杆菌的菌落呈现________(填颜色)。为了完成步骤二，该培养基中的成分Y通常是____________。
(2)完善步骤三，①是____________________________，②是___________________________。
(3)在纯化大肠杆菌前，将灭菌后的空平板先培养一段时间，目的是__________________。划线的某个平板培养后，第一划线区域长满了菌落，第二划线区域却无菌落产生，可能的原因是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是振荡培养能提高培养液中____________的含量和____________的利用率。
答案 (1)碳源 伊红美蓝 黑色 琼脂 (2)适量无菌水 取自该快餐店的等量冰块水 (3)检测培养基平板灭菌是否合格 接种环灼烧后未冷却便进行划线(或划线未从第一区域末端开始) (4)氧气 营养物质
解析 (1)乳糖是糖类物质，不含氮元素，所以培养基中的乳糖可为大肠杆菌提供碳源。鉴定大肠杆菌时，常使用伊红美蓝试剂，菌落出现的颜色是黑色。所以在培养基中添加的成分X是伊红美蓝。制作无菌平板是制作固体培养基，所以该培养基中还应加入琼脂，即成分Y是琼脂。(2)本实验是调查某快餐店的冰块中大肠杆菌的含量，故实验中对照组应接种适量无菌水，实验组应接种取自该快餐店的等量冰块水。(3)为了检测培养基平板灭菌是否合格，常在纯化大肠杆菌前，将灭菌后的空平板先培养一段时间，若平板上有菌落生长，说明灭菌不合格。接种环在平板内的每一次划线前，都要先灼烧灭菌冷却后再划线，而且要从上一次划线末端而非空白处划线，若不冷却会烫死上次划线末端的菌株，使以后的划线处没有菌落生长，若从空白处划线也不会有菌落生长。所以划线的某个平板培养后，第一划线区域长满了菌落，第二划线区域却无菌落产生，可能的原因是接种环灼烧后未冷却便进行划线(或划线未从第一区域末端开始)。(4)振荡培养可增加溶液中氧气的含量以及增加菌体与营养物质的接触，提高营养物质的利用率，从而使振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
5．(2019·广东中山七校联考改编)鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在________________________________________________________________________________
__________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。
(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是_____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案 (1)含碳有机物(或脂肪) 碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物 选择
(2)防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基水分蒸发过快
(3)稀释涂布平板法 D
(4)丙 每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析 (1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。
考点二 微生物的筛选和计数
1．筛选菌株的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．微生物计数
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程
土壤取样：富含有机质的土壤表层土
↓
样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，
适于计数的平板
↓
接种：用稀释涂布平板法接种
↓
培养
↓
观察：根据菌落的特征区分微生物
↓
计数：统计菌落的数目
↓
计算：根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]”进行计算
(4)分解尿素的细菌的鉴别
①方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
②原理
分解尿素的细菌
↓
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
↓
酚红指示剂 ―→ 变红色
③实验现象及结论
培养基变红：该种细菌能分解尿素。
培养基不变红：该种细菌不能分解尿素。
教材中的隐性知识 源于选修1 P24“旁栏问题”：测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌数目，选用的稀释范围不同，分离不同微生物采用的稀释度 不同。
4．土壤中分解纤维素的细菌的分离
(1)纤维素酶组成及作用
(2)纤维素分解菌的筛选
(3)实验流程
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( × )
(2)尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物( √ )
(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法( × )
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( √ )
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( × )
(6)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶( × )
(7)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
( × )
(8)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红( × )
(9)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度
( √ )
(1)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值。
(2)(源于选修1 P28“旁栏思考”)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。
1．两种微生物计数方法的比较
项目
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微镜计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝×M
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
注：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。
2．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
3.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
考向一 分解尿素的细菌的分离与计数
6．分离土壤中分解尿素的细菌的实验操作中，对于获得纯化的尿素分解菌的单菌落影响最大的是( )
A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B．涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
答案 C
7．(2020·四川乐山市调研)尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示。
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10 g
1 g
15 g
将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL。实验过程如图所示：
回答下列问题：
(1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括____________________
_______________________________________________________________________________
(答出两点即可)。能筛选出目的菌的原因是__________________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是 ______________。初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。
(3)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是_______(填序号)，需要消毒的是_______(填序号)。
①培养细菌的培养基与培养皿
②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管
③实验操作者的双手
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。
答案 (1)碳源、氮源(无机盐、水) 该培养基以尿素为唯一氮源 (2)稀释涂布平板法 酚红 红 (3)①② ③ (4)灭菌
解析 (1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括碳源、氮源、无机盐、水。能筛选出目的菌的原因是该培养基以尿素为唯一氮源。(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是稀释涂布平板法。尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定，原因是其体内产生的脲酶能够催化尿素分解为氨，使酚红指示剂变成红色。(3)培养细菌的培养基与培养皿、玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管都需要进行灭菌处理；实验操作者的双手需要进行消毒。(4)为避免污染环境，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉。
考向二 分解纤维素的微生物的分离
8．要从土壤中将分解纤维素的细菌分离出来，应该将它们接种在( )
A．加入指示剂的鉴定培养基上
B．含有蛋白胨的固体培养基上
C．只有纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上
D．含四大营养要素的培养基上
答案 C
9．(2020·吉林长春实验中学期末)科学家从羊等食草动物胃中筛选纤维素分解菌，并对其降解纤维素的能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)若科学家在____________平板上，发现以某种菌的菌落为中心的透明圈，则表明此种菌为纤维素分解菌。
(2)在纤维素分解菌的培养过程中应保持恒温箱中的温度约为________(填“4 ℃”“20 ℃”或“35 ℃”)。科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌。在实验前，需要使用__________________法对培养基进行灭菌；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，目的是____________________________________________________________。
(3)在接种的过程中，需要使用________(填“接种环”或“涂布器”)进行接种。科学家欲将筛选得到的纤维素分解菌进行大量培养，应选用________(填“液体”或“固体”)培养基，并以________为唯一碳源，配制此培养基时，________(填“能”或“不能”)使用牛肉膏作为氮源。
答案 (1)纤维素刚果红培养基 (2)35 ℃ 高压蒸汽灭菌 检测培养基平板灭菌是否合格 (3)涂布器 液体 纤维素 不能
解析 (1)用纤维素刚果红培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。(2)4 ℃、20 ℃、35 ℃三个温度中，35 ℃最接近纤维素分解菌的生活环境——羊胃的温度，故培养过程中应保持恒温培养箱中的温度约为35 ℃。培养基灭菌一般用高压蒸汽灭菌法。在接种之前，要随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌，故需要使用涂布器进行接种。
考向三 微生物筛选、计数的综合运用
10．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法不正确的是( )
A．倒成平板后直接培养可判断有无污染
B．倒成平板后不需要进行灭菌处理
C．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
D．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
答案 C
11．(2019·全国Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题：
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是__________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和__________________。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 X (2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 (3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
1．核心概念
(1)(选修1 P14)培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)(选修1 P15)消毒：使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
(3)(选修1 P15)灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(选修1 P18)平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
(5)(选修1 P19)稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(6)(选修1 P18)菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(7)(选修1 P22)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．教材结论性语句
(1)(选修1 P22)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
(2)(选修1 P26)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如pH升高，指示剂将变红，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案 B
解析 温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
2．(2020·山东，20)野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是( )
A．操作过程中出现杂菌污染
B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
答案 B
解析 据题意可知，甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独培养时均不会在基本培养基上出现菌落，两者混合培养一段时间后，再接种在基本培养基中却出现菌落，除了操作过程中出现杂菌污染，杂菌在基本培养基上生长形成菌落的原因以外，还可能的原因是菌株获得了对方的遗传物质，或菌株中已突变的基因再次发生突变，使突变菌株能产生所需的氨基酸，而变成了非依赖型菌株，从而能在基本培养基上生长形成菌落，A、C、D项正确；M、N菌株混合培养一段时间，稀释涂布到基本培养基上后，培养出现的菌落是由单个细菌形成的，菌落中不可能有M、N菌株同时存在而互为对方提供所缺失的氨基酸，故B项错误。
3．(2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D．适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化
答案 A
解析 以尿素为唯一氮源的固体培养基是选择培养基，让能利用尿素的微生物生长，其他微生物不能生长，但不能迅速杀死其他微生物，A项错误；不同微生物生长的适宜pH不同，如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性，B项正确；酵母菌酿酒时直接利用的物质是葡萄糖，因此酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒，C项正确；醋酸发酵时，适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化，较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的活化，D项正确。
4．(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经________________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌____________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)④
(2)梯度稀释 4.6×105(或460 000)
(3)诱变 脂肪 较大
(4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析 (2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在30～300个的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5．(2020·全国Ⅰ，37)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用__________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_________________________________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：____________________
_____________________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
(2)104
(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
(5)水、碳源、氮源和无机盐
解析 (1)微生物培养过程中，培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌的方法。乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是可使液体培养基凝固的琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此是选择培养基。(2)设稀释倍数为A,1 mL＝1 000 μL，可得(2×107/A)×0.1≤200，解得A≥104。(3)在筛选降解S物质的细菌的过程中，如果培养基中的S浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对S的降解量反而下降(或者S改变了培养基的pH，导致细菌代谢活性降低)。(4)测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是①淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中；②用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；③微生物培养与观察计数。(5)培养基中含有细菌生长所需要的4类基本营养物质，即水、碳源、氮源、无机盐。
6．(2019·全国Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择______菌落进一步纯化，选择的依据是________________
_______________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明______________________________________。
答案 (1)W
(2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
(4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
解析 (1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
课时精练
1．(2019·江西赣州摸底改编)蓝纹奶酪是成熟过程中内部生长蓝绿霉菌的一类奶酪的总称，又称为青纹奶酪。回答下列问题：
(1)蓝纹奶酪的原材料为牛奶，使用的消毒法为________________。
(2)蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌，原因是
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________。
(3)实验室分离培养类地青霉通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“麦芽汁琼脂”或“马铃薯琼脂”)培养基，该培养基一般用______________法灭菌。
(4)在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有________、________和高压蒸汽灭菌。
(5)灭菌结束后，待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰旁将培养基倒入灭菌后的培养皿中，这个操作称为________。此过程还需要将锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是________________________________________________________________________。
答案 (1)巴氏消毒法 (2)缺氧和较低pH的环境可以抑制其他细菌的生长繁殖 (3)马铃薯琼脂 高压蒸汽灭菌 (4)灼烧灭菌 干热灭菌 (5)倒平板 防止瓶口微生物污染培养基
解析 (1)牛奶使用巴氏消毒法消毒。(2)乳酸菌进行无氧呼吸产生乳酸，发酵液处于缺氧和较低pH的环境中，这样可以抑制其他杂菌的生长繁殖，故蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌。(3)类地青霉属于真菌，实验室分离培养类地青霉通常使用马铃薯琼脂培养基，培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌。
2．(2020·重庆市调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，并且影响其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为可以被吸收利用的磷酸盐等。如图是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析回答问题：
(1)实验室中筛选微生物的原理是_________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须________________________。
(2)请写出一种纯化得到植酸酶的方法：__________________，其原理是________________
______________________________________________________________________________。
(3)现将从100 mL含有产植酸酶菌的土壤样品溶液中取出的1 mL样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为150，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中含有产植酸酶菌________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(4)由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。实验结果显示的A～E五种菌株中，________是产植酸酶的最理想菌株。
(5)通常对获得的纯菌种还可以依据菌落的__________________________________等菌落特征对细菌进行初步的鉴定(或分类)。
答案 (1)人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长(合理即可) 调节pH (2)凝胶色谱法 根据蛋白质相对分子质量大小进行纯化(或电泳法 根据待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同进行纯化) (3)1.5×109 偏小 (4)E (5)形状、大小、颜色
解析 (3)100 mL原菌液中含有产植酸酶菌(150÷0.1)×104×100＝1.5×109(个)，因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏少。(4)根据题意可知，透明区域越大，说明植酸酶越多，故E是最理想菌株。
3．(2021·贵州遵义模拟)油烟由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到某品牌食用油产生的油烟污染的土壤中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示，回答下列问题：
(1)图中①→③的过程称为________，其目的是_______________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)该同学将③中的微生物培养液接种到培养基④之前，进行了梯度稀释，制成稀释倍数分别为101、102、103的不同稀释度的样品液，分别吸取0.1 mL样品液涂布于培养基上。每个稀释倍数的样品液涂布三个培养基，最终形成的菌落的数目如表所示：
培养基编号
稀释倍数
甲
乙
丙
101
168
172
170
102
12
14
19
103
2
3
6
应选择稀释倍数为________的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目为________个，这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果小，其原因是
______________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是__________________________。培养基常用的灭菌方法是_________________________________________________________。
答案 (1)选择培养 初步筛选出能降解油烟的微生物，并增大其浓度 (2)101 1.7×104 该方法只是统计活菌数量，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落 (3)为微生物提供碳源和能源 高压蒸汽灭菌法
解析 (1)分析图解可知，图中①→③的培养过程中加入某品牌食用油作为唯一碳源，能够初步筛选出能降解油烟的微生物，因此称为选择培养。(2)利用稀释涂布平板法对微生物进行计数时选择菌落数在30～300的进行计数，结合表格数据可知，应选择稀释倍数为101的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目＝(168＋172＋170)÷3÷0.1×101＝1.7×104(个)。该方法只是统计活菌数目，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落，因此这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果偏小。(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是为微生物提供碳源和能源。培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。
4．幽门螺旋杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素，据研究发现，目前我国有超过50%的人感染了Hp病菌。Hp是微需氧菌，环境氧要求5%～8%，在大气或绝对厌氧环境下均能生长，Hp中某种酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下生存。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤为：配制培养基→灭菌、倒平板→X→培养→观察。请回答：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有____________________，所以它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。
(2)步骤X的操作如图所示：
①微生物接种的方法有很多，但都要注意__________________；上图所示方法为________________。
②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是_______________。
(3)在培养时，需将培养皿______并放在恒温培养箱中。
答案 (1)脲酶 红 (2)①防止外来杂菌的入侵 稀释涂布平板法 ②使微生物和无菌水混合均匀 (3)倒置
解析 (1)由于幽门螺旋杆菌含有能将尿素分解成氨的酶即脲酶，而氨会使培养基碱性增强，即pH升高，导致酚红指示剂变红。
(2)①微生物接种的方法有很多，但都要注意防止外来杂菌的入侵。接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法。题图为稀释涂布平板法。②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。
(3)培养时需将培养皿倒置并放在恒温箱中培养，倒置培养的目的是防止皿盖上冷凝的水珠滴在培养基中污染培养基。
5．(2020·白银模拟)秸秆还田的过程中，配施适量的高效纤维素分解菌，能有效促进秸秆分解，提高秸秆还田效率，且不会造成环境污染。回答下列问题：
(1)筛选纤维素分解菌时，可到腐烂稻草等环境中采集土样，原因是_______________________
_______________________________________________________________________________。
(2)有很多类群微生物都能有效降解纤维素，为了避免不同微生物之间的生长互相影响，应该用______________培养基进行培养，获得纯化菌株。
(3)用刚果红染色法初步鉴定纤维素分解菌后，进一步用液体滤纸培养基分组复筛，其中滤纸的作用是____________________。培养一段时间后，将残留的滤纸烘干称重，残留的滤纸越少，则说明____________________________________________________________________。
(4)采用__________________技术，将筛选到的高效纤维素分解菌固定，能够阻隔其受到外界不利因素的毒害作用，增加使用寿命。
(5)为了长期保存高效纤维素分解菌菌种，可以采用__________________的方法。
(6)现有高效分解纤维素的细菌，为探究其最适pH，某同学设计如下实验：取锥形瓶若干分为4组，加入等量秸秆及其他必需营养物质，分别设置pH为1、3、6、7，接种等量纤维素分解细菌，培养一段时间后，测定各组锥形瓶中秸秆减少量的平均值。该pH设置的不足之处有____________和____________。
答案 (1)腐烂稻草的土壤富含纤维素分解菌 (2)选择 (3)提供纤维素 纤维素分解菌的分解能力越强 (4)固定化细胞 (5)甘油管藏 (6)pH范围设置不合理 pH梯度设置不合理
解析 (3)要筛选到能产生纤维素酶的微生物，应使用选择培养基，在培养基中加入纤维素作为唯一碳源，能在此培养基中存活的微生物就是能产生纤维素酶的微生物，故滤纸的作用是提供纤维素。培养一段时间后，将残留的滤纸烘干称重，残留的滤纸越少，则说明纤维素分解菌的分解能力越强。
6．乳酸菌是对人体有益的微生物之一，常用于产生酸奶，其发酵产物为乳酸，能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙。为检测某品牌酸奶中的乳酸菌含量是否达标，检验人员进行了相关实验。回答下列问题：
(1)配制培养基：培养基中除含水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和______________。
(2)稀释样品：取1 mL待测酸奶，用______进行梯度稀释。
(3)接种培养：用______________法接种，培养时控制的气体条件是________________。
(4)观察计数：菌落周围出现____________的就是乳酸菌的菌落，选择菌落数在________的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是____________________________________。
答案 (1)CaCO3 (2)无菌水 (3)稀释涂布平板 无氧 (4)透明圈(或溶钙圈) 30～300 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
解析 (1)乳酸菌的发酵产物乳酸，能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙，因此配制培养乳酸菌的培养基除加入水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和CaCO3。(2)计数乳酸菌前，需用无菌水将待测酸奶稀释至合适浓度。(3)计数乳酸菌需用稀释涂布平板法接种，乳酸菌是厌氧菌，培养时控制的气体条件是无氧。(4)乳酸能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙，不透明的培养基上出现透明(溶钙)圈的就是乳酸菌的菌落。细菌计数时，常选择菌落数在30～300的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
7．(2020·合肥市质检)如图是纯化纤维素分解菌并生产乙醇的基本工作流程，请回答下列问题：
(1)图中①过程应选取富含纤维素的土壤，在鉴定和筛选所需微生物时需用________对纤维素进行染色并制成选择培养基，最后还要在平板培养基上分离纯化目的菌。为避免杂菌污染培养物和环境，接种时要在______________旁操作。
(2)图中②环节获得的酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，分别为C1酶、CX酶和______________。前两种酶使纤维素酶分解成____________，第三种酶将前两种酶的分解产物分解成葡萄糖。⑤环节常用的菌种是___________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(3)用稀释涂布平板法测定一土壤样品中纤维素分解菌数量。在对应稀释倍数为106的稀释液中，取0.2 mL稀释液涂布，得到以下统计结果：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和246；请计算每毫升原液中的菌体数是______________。
答案 (1)刚果红 酒精灯火焰 (2)葡萄糖苷酶 纤维二糖 酵母菌 (3)1.16×109
解析 (1)分析题图可知，图中①过程表示纤维素分解菌的筛选，因此应选择富含纤维素的土壤，在鉴定和筛选所需微生物时需用刚果红对纤维素进行染色并制成选择培养基，最后还要在平板培养基上分离纯化目的菌。为避免杂菌污染培养物和环境，接种时要在酒精灯火焰旁操作。(2)从目的菌中得到的纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，分别为C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。⑤过程表示无氧发酵产生乙醇的过程，此过程常用的菌种是酵母菌。(3)涂布的三个平板上菌落的平均值为(210＋240＋246)/3＝232。原液中的菌体密度是232÷0.2×106＝1.16×109(个/mL)。
第37讲 微生物的利用
[目标要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。
考点一 微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类
①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
2．无菌技术
(1)目的：获得纯净培养物。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)常用方法：灭菌和消毒。
(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)
教材中的隐性知识 源于选修1 P85附录4“高压灭菌的操作方法”
(1)灭菌桶装入待灭菌物品不要装太挤的原因是避免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
(2)加热灭菌锅时应打开排气阀，目的是排除锅内冷空气，之后，才能关上排气阀。
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)计算
↓
(2)称量
↓
(3)溶化
↓
(4)灭菌
↓
(5)倒平板
4．纯化培养
(1)方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(2)菌落的概念：由单个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(3)平板划线法分离纯化大肠杆菌
①
接种
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，在摇床上37 ℃下振荡培养12 h
②
划线
分离
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中沾取菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿
③
培养
观察
将培养皿倒置，放在37 ℃恒温箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落
(4)稀释涂布平板法步骤
①系列稀释操作：该操作常用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。
操作步骤：
②涂布平板操作步骤
教材中的隐性知识 源于选修1 P18“旁栏小资料”
(1)微生物的接种方法除平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。
(2)微生物接种的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
5．菌种的保藏方法
主要方法
临时保藏法
甘油管藏法
保藏对象
频繁使用的菌种
长期保藏的菌种
方法步骤
先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4 ℃的冰箱中
转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20 ℃冷冻箱中保存
(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质( √ )
(2)由于物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型( × )
(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( √ )
(4)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌( × )
(5)配制培养基时应先灭菌再调pH( × )
(6)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧( √ )
(7)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( × )
(8)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落
( √ )
(9)斜面培养基中含有大量营养物质，可在常温下长期保存菌株( × )
(10)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( × )
源于选修1 P17～18讨论
(1)平板冷凝后，要将平板倒置，原因是可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；避免培养基水分过快挥发。
(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能用来培养微生物，原因是空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
(3)平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，原因是划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
1．选择培养基与鉴别培养基的比较
项目
选择培养基
鉴别培养基
制备方法
培养基中加入某些化学物质
培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理
依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计
产生特定的颜色或其他变化
用途
从众多微生物中分离出所需的微生物
鉴别不同种类的微生物
2.消毒和灭菌的辨析
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽灭菌法
培养基及容器的灭菌
3.两种纯化方法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
分离结果
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释②涂布平板操作
接种用具
接种环
涂布器
注意事项
(1)接种环的灼烧：①第一次划线前，避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；②再次划线前，杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种直接来源于上次划线的末端；③划线结束后，杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(2)接种环灼烧后，要冷却后才能接触菌液，以免温度太高杀死菌种。
(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破
(1)在进行稀释操作时，每支试管及其中的9 mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时：①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时要让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃；②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何其他物体
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点
都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
考向一 培养基与无菌技术
1．(2019·安徽定远一模)下表所示是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题：
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
显色剂(伊红美蓝)
琼脂
含量
10.0 g
5.0 g
5.0 g
2.0 g
0.2 g
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)根据用途划分，该培养基属于____________培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基作出的最关键的调整是____________________，若还需鉴定分解尿素的细菌，需做出的调整是________________________。
(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为____________。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？
________________________________________________________________________。
答案 (1)鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红 (2)异养型 不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存
解析 (1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存，因此该培养基不能分离筛选出大肠杆菌。
2．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________________。在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________________。
答案 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气
(5)未将锅内冷空气排尽
考向二 微生物的培养
3．下列有关“微生物的分离与培养”实验的叙述正确的是( )
A．高压蒸汽灭菌锅加盖时应按顺时针方向依次旋紧每一个螺栓
B．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类
C．对培养皿进行编号或对菌种进行标注时，应使用记号笔在皿底标记
D．利用平板划线法可对微生物进行接种、纯化、分离和计数
答案 C
4．(2020·汕头质检)某生物兴趣小组的同学计划调查某快餐店的冰块中大肠杆菌的含量。具体实验步骤如下：
第一步：配制培养基(成分：蛋白胨、氯化钠、乳糖、水、X和Y)。
第二步：制作无菌平板(含成分Y)。
第三步：设置空白对照组和实验组，对照组接种①，实验组接种②。
第四步：将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)培养基中的乳糖可以为大肠杆菌提供____________。为了方便大肠杆菌的鉴定，需要在培养基中添加成分X______________，在该培养基表面，大肠杆菌的菌落呈现________(填颜色)。为了完成步骤二，该培养基中的成分Y通常是____________。
(2)完善步骤三，①是____________________________，②是___________________________。
(3)在纯化大肠杆菌前，将灭菌后的空平板先培养一段时间，目的是__________________。划线的某个平板培养后，第一划线区域长满了菌落，第二划线区域却无菌落产生，可能的原因是______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是振荡培养能提高培养液中____________的含量和____________的利用率。
答案 (1)碳源 伊红美蓝 黑色 琼脂 (2)适量无菌水 取自该快餐店的等量冰块水 (3)检测培养基平板灭菌是否合格 接种环灼烧后未冷却便进行划线(或划线未从第一区域末端开始) (4)氧气 营养物质
解析 (1)乳糖是糖类物质，不含氮元素，所以培养基中的乳糖可为大肠杆菌提供碳源。鉴定大肠杆菌时，常使用伊红美蓝试剂，菌落出现的颜色是黑色。所以在培养基中添加的成分X是伊红美蓝。制作无菌平板是制作固体培养基，所以该培养基中还应加入琼脂，即成分Y是琼脂。(2)本实验是调查某快餐店的冰块中大肠杆菌的含量，故实验中对照组应接种适量无菌水，实验组应接种取自该快餐店的等量冰块水。(3)为了检测培养基平板灭菌是否合格，常在纯化大肠杆菌前，将灭菌后的空平板先培养一段时间，若平板上有菌落生长，说明灭菌不合格。接种环在平板内的每一次划线前，都要先灼烧灭菌冷却后再划线，而且要从上一次划线末端而非空白处划线，若不冷却会烫死上次划线末端的菌株，使以后的划线处没有菌落生长，若从空白处划线也不会有菌落生长。所以划线的某个平板培养后，第一划线区域长满了菌落，第二划线区域却无菌落产生，可能的原因是接种环灼烧后未冷却便进行划线(或划线未从第一区域末端开始)。(4)振荡培养可增加溶液中氧气的含量以及增加菌体与营养物质的接触，提高营养物质的利用率，从而使振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
5．(2019·广东中山七校联考改编)鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在________________________________________________________________________________
__________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。
(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是_____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案 (1)含碳有机物(或脂肪) 碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物 选择
(2)防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基水分蒸发过快
(3)稀释涂布平板法 D
(4)丙 每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析 (1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。
考点二 微生物的筛选和计数
1．筛选菌株的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．微生物计数
3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程
土壤取样：富含有机质的土壤表层土
↓
样品的稀释：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，
适于计数的平板
↓
接种：用稀释涂布平板法接种
↓
培养
↓
观察：根据菌落的特征区分微生物
↓
计数：统计菌落的数目
↓
计算：根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]”进行计算
(4)分解尿素的细菌的鉴别
①方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
②原理
分解尿素的细菌
↓
CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3
↓
酚红指示剂 ―→ 变红色
③实验现象及结论
培养基变红：该种细菌能分解尿素。
培养基不变红：该种细菌不能分解尿素。
教材中的隐性知识 源于选修1 P24“旁栏问题”：测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌数目，选用的稀释范围不同，分离不同微生物采用的稀释度 不同。
4．土壤中分解纤维素的细菌的分离
(1)纤维素酶组成及作用
(2)纤维素分解菌的筛选
(3)实验流程
(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( × )
(2)尿素在脲酶的催化作用下分解成无机物( √ )
(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法( × )
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( √ )
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( × )
(6)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶( × )
(7)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
( × )
(8)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红( × )
(9)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度
( √ )
(1)统计某一稀释度下平板上的菌落数的要求是统计3个菌落数在30～300之间的平板，计算菌落数的平均值。
(2)(源于选修1 P28“旁栏思考”)在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。
1．两种微生物计数方法的比较
项目
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微镜计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝×M
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
注：细菌的数目还可以通过滤膜法来测定。
2．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
3.微生物的分离与计数实验中对照组和重复组的设置及作用
(1)两种对照组的设置及作用
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置至少3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
考向一 分解尿素的细菌的分离与计数
6．分离土壤中分解尿素的细菌的实验操作中，对于获得纯化的尿素分解菌的单菌落影响最大的是( )
A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B．涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
答案 C
7．(2020·四川乐山市调研)尿素是一种重要的农业肥料，经微生物分解后能更好地被植物利用。某生物兴趣小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计实验并成功筛选到能高效分解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示。
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10 g
1 g
15 g
将表中物质溶解后，用蒸馏水定容到100 mL。实验过程如图所示：
回答下列问题：
(1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括____________________
_______________________________________________________________________________
(答出两点即可)。能筛选出目的菌的原因是__________________________________________
______________________________________________________________________________。
(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是 ______________。初步筛选出来的菌种还需要进一步的鉴定：在培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可说明该菌种能够分解尿素。
(3)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是_______(填序号)，需要消毒的是_______(填序号)。
①培养细菌的培养基与培养皿
②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管
③实验操作者的双手
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。
答案 (1)碳源、氮源(无机盐、水) 该培养基以尿素为唯一氮源 (2)稀释涂布平板法 酚红 红 (3)①② ③ (4)灭菌
解析 (1)该培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型包括碳源、氮源、无机盐、水。能筛选出目的菌的原因是该培养基以尿素为唯一氮源。(2)图中将细菌接种到固体培养基上时，采用的方法是稀释涂布平板法。尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定，原因是其体内产生的脲酶能够催化尿素分解为氨，使酚红指示剂变成红色。(3)培养细菌的培养基与培养皿、玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管都需要进行灭菌处理；实验操作者的双手需要进行消毒。(4)为避免污染环境，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉。
考向二 分解纤维素的微生物的分离
8．要从土壤中将分解纤维素的细菌分离出来，应该将它们接种在( )
A．加入指示剂的鉴定培养基上
B．含有蛋白胨的固体培养基上
C．只有纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上
D．含四大营养要素的培养基上
答案 C
9．(2020·吉林长春实验中学期末)科学家从羊等食草动物胃中筛选纤维素分解菌，并对其降解纤维素的能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)若科学家在____________平板上，发现以某种菌的菌落为中心的透明圈，则表明此种菌为纤维素分解菌。
(2)在纤维素分解菌的培养过程中应保持恒温箱中的温度约为________(填“4 ℃”“20 ℃”或“35 ℃”)。科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌。在实验前，需要使用__________________法对培养基进行灭菌；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，目的是____________________________________________________________。
(3)在接种的过程中，需要使用________(填“接种环”或“涂布器”)进行接种。科学家欲将筛选得到的纤维素分解菌进行大量培养，应选用________(填“液体”或“固体”)培养基，并以________为唯一碳源，配制此培养基时，________(填“能”或“不能”)使用牛肉膏作为氮源。
答案 (1)纤维素刚果红培养基 (2)35 ℃ 高压蒸汽灭菌 检测培养基平板灭菌是否合格 (3)涂布器 液体 纤维素 不能
解析 (1)用纤维素刚果红培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。(2)4 ℃、20 ℃、35 ℃三个温度中，35 ℃最接近纤维素分解菌的生活环境——羊胃的温度，故培养过程中应保持恒温培养箱中的温度约为35 ℃。培养基灭菌一般用高压蒸汽灭菌法。在接种之前，要随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)科学家采用稀释涂布平板法分离、纯化纤维素分解菌，故需要使用涂布器进行接种。
考向三 微生物筛选、计数的综合运用
10．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，某研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示，下列说法不正确的是( )
A．倒成平板后直接培养可判断有无污染
B．倒成平板后不需要进行灭菌处理
C．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
D．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
答案 C
11．(2019·全国Ⅰ，37)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题：
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是__________________。Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会____________，其原因是__________________________________________________________
_______________________________________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供____________和__________________。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 X (2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 (3)稀释涂布平板法 (4)能量 合成其他物质的原料
解析 (1)牛肉膏蛋白胨培养基中，牛肉膏、蛋白胨为微生物生长提供了氮源，而Ⅱ、Ⅲ号培养基中除X外的其他物质均不含碳，所以能为微生物提供碳源的有机物是X。(2)因为Ⅱ号培养基中碳源只有X，属于选择培养基，只有能降解X的细菌才能增殖，而不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖。(3)要对菌落进行计数，应采用稀释涂布平板法进行接种。(4)在有氧条件下，丙酮酸参与细菌的有氧呼吸，可以为该菌的生长提供能量和合成其他物质的原料。
1．核心概念
(1)(选修1 P14)培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)(选修1 P15)消毒：使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
(3)(选修1 P15)灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(4)(选修1 P18)平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
(5)(选修1 P19)稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(6)(选修1 P18)菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(7)(选修1 P22)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．教材结论性语句
(1)(选修1 P22)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
(2)(选修1 P26)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如pH升高，指示剂将变红，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．(2020·江苏，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
答案 B
解析 温度降低后，培养基易凝固，因此倒平板后要及时轻轻晃动，以保持均一性，A项错误；由题图可见，随着划线次数增多，细菌密度减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B项正确；菌落是由单个微生物细胞或多个同种细胞繁殖到一定程度后形成的，能得到单菌落即可以达到菌种纯化的目的，C项错误；刚果红与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D项错误。
2．(2020·山东，20)野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是( )
A．操作过程中出现杂菌污染
B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸
C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质
D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变
答案 B
解析 据题意可知，甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独培养时均不会在基本培养基上出现菌落，两者混合培养一段时间后，再接种在基本培养基中却出现菌落，除了操作过程中出现杂菌污染，杂菌在基本培养基上生长形成菌落的原因以外，还可能的原因是菌株获得了对方的遗传物质，或菌株中已突变的基因再次发生突变，使突变菌株能产生所需的氨基酸，而变成了非依赖型菌株，从而能在基本培养基上生长形成菌落，A、C、D项正确；M、N菌株混合培养一段时间，稀释涂布到基本培养基上后，培养出现的菌落是由单个细菌形成的，菌落中不可能有M、N菌株同时存在而互为对方提供所缺失的氨基酸，故B项错误。
3．(2020·浙江7月选考)下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是( )
A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物
B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D．适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化
答案 A
解析 以尿素为唯一氮源的固体培养基是选择培养基，让能利用尿素的微生物生长，其他微生物不能生长，但不能迅速杀死其他微生物，A项错误；不同微生物生长的适宜pH不同，如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将培养基的pH调至中性或微碱性，B项正确；酵母菌酿酒时直接利用的物质是葡萄糖，因此酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒，C项正确；醋酸发酵时，适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化，较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的活化，D项正确。
4．(2020·江苏，31)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
(1)常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是________(填编号)。
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧
(2)称取1.0 g某土壤样品，转入99 mL无菌水中，制备成菌悬液，经________________后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌____________个。
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以________为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径________的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
(4)在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株________进行后续相关研究，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)④
(2)梯度稀释 4.6×105(或460 000)
(3)诱变 脂肪 较大
(4)B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
解析 (2)利用稀释涂布平板法统计活菌数目时，需要将制备的菌悬液进行梯度稀释，以获得细胞密度不同的菌悬液，一般来说，菌落数在30～300个的平板最适于计数。0.1 mL菌悬液中含有46个酵母菌落，则1 mL菌悬液中含有460个酵母菌落；1.0 g土壤样品首先稀释100倍，然后稀释10倍，共稀释了1 000倍，因此样本中每克土壤约含酵母菌460×1 000＝4.6×105(个)。(3)采用射线辐照引起酵母菌基因突变，此种方法属于诱变育种。检查诱变酵母菌产脂肪酶的能力，需要把酵母菌接种到以脂肪为唯一碳源的培养基上，按照产生菌落直径大小进行初步筛选，直径大的说明产酶能力强，利用的脂肪(碳源)多，直径小的说明产酶能力弱，利用的脂肪(碳源)少。(4)通过分析题图可知，相同时间内，菌株B细胞密度大，说明该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；相同时间内，菌株B利用的脂肪多，脂肪剩余量少，说明该菌株降解脂肪的能力强，净化效果好。
5．(2020·全国Ⅰ，37)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用__________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_________________________________________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：____________________
_____________________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即____________________________________________________________________
______________________________________________________________________________。
答案 (1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
(2)104
(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
(5)水、碳源、氮源和无机盐
解析 (1)微生物培养过程中，培养基的灭菌通常采用高压蒸汽灭菌的方法。乙培养基为固体培养基，因此培养基中加入的是可使液体培养基凝固的琼脂。甲、乙两种培养基都是为了分离出可降解S的细菌，因此是选择培养基。(2)设稀释倍数为A,1 mL＝1 000 μL，可得(2×107/A)×0.1≤200，解得A≥104。(3)在筛选降解S物质的细菌的过程中，如果培养基中的S浓度过高，会导致细菌培养基的渗透压增大，细菌失水而代谢活性降低，对S的降解量反而下降(或者S改变了培养基的pH，导致细菌代谢活性降低)。(4)测定淤泥中能降解S的细菌细胞数的主要步骤是①淤泥取样，即取少量的淤泥加入无菌水中；②用稀释涂布平板法涂布到乙培养基上；③微生物培养与观察计数。(5)培养基中含有细菌生长所需要的4类基本营养物质，即水、碳源、氮源、无机盐。
6．(2019·全国Ⅱ，37)物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题：
(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是________。
(2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择______菌落进一步纯化，选择的依据是________________
_______________________________________________________________________________。
(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即______________
_______________________________________________________________________________。
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加__________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明____________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明______________________________________。
答案 (1)W
(2)乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
(4)①缓冲液 ②缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
解析 (1)要从土壤中分离出能降解含氮有机物W的目标菌，所用选择培养基应以该特定物质W为氮源。(2)题图信息显示，在乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W，若要得到目标菌，应该选择乙菌落进一步纯化。(3)若要通过设计实验确定甲、乙两种细菌能否利用空气中的氮气作为氮源，需将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若某细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①实验应遵循单一变量原则，故C处应滴加缓冲液。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明缓冲液不能降解W；若A、B处形成的透明圈大小相近，说明酶E与天然酶降解W的能力相近。
课时精练
1．(2019·江西赣州摸底改编)蓝纹奶酪是成熟过程中内部生长蓝绿霉菌的一类奶酪的总称，又称为青纹奶酪。回答下列问题：
(1)蓝纹奶酪的原材料为牛奶，使用的消毒法为________________。
(2)蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌，原因是
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________。
(3)实验室分离培养类地青霉通常使用____________(填“牛肉膏蛋白胨”“麦芽汁琼脂”或“马铃薯琼脂”)培养基，该培养基一般用______________法灭菌。
(4)在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有________、________和高压蒸汽灭菌。
(5)灭菌结束后，待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰旁将培养基倒入灭菌后的培养皿中，这个操作称为________。此过程还需要将锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是________________________________________________________________________。
答案 (1)巴氏消毒法 (2)缺氧和较低pH的环境可以抑制其他细菌的生长繁殖 (3)马铃薯琼脂 高压蒸汽灭菌 (4)灼烧灭菌 干热灭菌 (5)倒平板 防止瓶口微生物污染培养基
解析 (1)牛奶使用巴氏消毒法消毒。(2)乳酸菌进行无氧呼吸产生乳酸，发酵液处于缺氧和较低pH的环境中，这样可以抑制其他杂菌的生长繁殖，故蓝纹奶酪制作所用的初级发酵剂为乳酸菌，初级发酵过程中不需要严格灭菌。(3)类地青霉属于真菌，实验室分离培养类地青霉通常使用马铃薯琼脂培养基，培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌。
2．(2020·重庆市调研)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，并且影响其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化植酸钙水解成为可以被吸收利用的磷酸盐等。如图是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析回答问题：
(1)实验室中筛选微生物的原理是_________________________________________________
_____________________________________________________________________________。
配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须________________________。
(2)请写出一种纯化得到植酸酶的方法：__________________，其原理是________________
______________________________________________________________________________。
(3)现将从100 mL含有产植酸酶菌的土壤样品溶液中取出的1 mL样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为150，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中含有产植酸酶菌________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(4)由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。实验结果显示的A～E五种菌株中，________是产植酸酶的最理想菌株。
(5)通常对获得的纯菌种还可以依据菌落的__________________________________等菌落特征对细菌进行初步的鉴定(或分类)。
答案 (1)人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长(合理即可) 调节pH (2)凝胶色谱法 根据蛋白质相对分子质量大小进行纯化(或电泳法 根据待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同进行纯化) (3)1.5×109 偏小 (4)E (5)形状、大小、颜色
解析 (3)100 mL原菌液中含有产植酸酶菌(150÷0.1)×104×100＝1.5×109(个)，因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏少。(4)根据题意可知，透明区域越大，说明植酸酶越多，故E是最理想菌株。
3．(2021·贵州遵义模拟)油烟由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到某品牌食用油产生的油烟污染的土壤中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示，回答下列问题：
(1)图中①→③的过程称为________，其目的是_______________________________________
_______________________________________________________________________________。
(2)该同学将③中的微生物培养液接种到培养基④之前，进行了梯度稀释，制成稀释倍数分别为101、102、103的不同稀释度的样品液，分别吸取0.1 mL样品液涂布于培养基上。每个稀释倍数的样品液涂布三个培养基，最终形成的菌落的数目如表所示：
培养基编号
稀释倍数
甲
乙
丙
101
168
172
170
102
12
14
19
103
2
3
6
应选择稀释倍数为________的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目为________个，这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果小，其原因是
______________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________。
(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是__________________________。培养基常用的灭菌方法是_________________________________________________________。
答案 (1)选择培养 初步筛选出能降解油烟的微生物，并增大其浓度 (2)101 1.7×104 该方法只是统计活菌数量，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落 (3)为微生物提供碳源和能源 高压蒸汽灭菌法
解析 (1)分析图解可知，图中①→③的培养过程中加入某品牌食用油作为唯一碳源，能够初步筛选出能降解油烟的微生物，因此称为选择培养。(2)利用稀释涂布平板法对微生物进行计数时选择菌落数在30～300的进行计数，结合表格数据可知，应选择稀释倍数为101的培养基进行计数，稀释前每毫升菌液中含有油烟降解菌的数目＝(168＋172＋170)÷3÷0.1×101＝1.7×104(个)。该方法只是统计活菌数目，并且当两个或多个细胞连在一起时，观察到的只是一个菌落，因此这种计数方法统计的结果往往会比显微镜直接计数的结果偏小。(3)在⑤的固体培养基中应加入该品牌食用油，其作用是为微生物提供碳源和能源。培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。
4．幽门螺旋杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素，据研究发现，目前我国有超过50%的人感染了Hp病菌。Hp是微需氧菌，环境氧要求5%～8%，在大气或绝对厌氧环境下均能生长，Hp中某种酶催化尿素水解形成“氨云”保护细菌在高酸环境下生存。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤为：配制培养基→灭菌、倒平板→X→培养→观察。请回答：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有____________________，所以它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现________色环带。
(2)步骤X的操作如图所示：
①微生物接种的方法有很多，但都要注意__________________；上图所示方法为________________。
②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是_______________。
(3)在培养时，需将培养皿______并放在恒温培养箱中。
答案 (1)脲酶 红 (2)①防止外来杂菌的入侵 稀释涂布平板法 ②使微生物和无菌水混合均匀 (3)倒置
解析 (1)由于幽门螺旋杆菌含有能将尿素分解成氨的酶即脲酶，而氨会使培养基碱性增强，即pH升高，导致酚红指示剂变红。
(2)①微生物接种的方法有很多，但都要注意防止外来杂菌的入侵。接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法。题图为稀释涂布平板法。②图示每次取样前需用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。
(3)培养时需将培养皿倒置并放在恒温箱中培养，倒置培养的目的是防止皿盖上冷凝的水珠滴在培养基中污染培养基。
5．(2020·白银模拟)秸秆还田的过程中，配施适量的高效纤维素分解菌，能有效促进秸秆分解，提高秸秆还田效率，且不会造成环境污染。回答下列问题：
(1)筛选纤维素分解菌时，可到腐烂稻草等环境中采集土样，原因是_______________________
_______________________________________________________________________________。
(2)有很多类群微生物都能有效降解纤维素，为了避免不同微生物之间的生长互相影响，应该用______________培养基进行培养，获得纯化菌株。
(3)用刚果红染色法初步鉴定纤维素分解菌后，进一步用液体滤纸培养基分组复筛，其中滤纸的作用是____________________。培养一段时间后，将残留的滤纸烘干称重，残留的滤纸越少，则说明____________________________________________________________________。
(4)采用__________________技术，将筛选到的高效纤维素分解菌固定，能够阻隔其受到外界不利因素的毒害作用，增加使用寿命。
(5)为了长期保存高效纤维素分解菌菌种，可以采用__________________的方法。
(6)现有高效分解纤维素的细菌，为探究其最适pH，某同学设计如下实验：取锥形瓶若干分为4组，加入等量秸秆及其他必需营养物质，分别设置pH为1、3、6、7，接种等量纤维素分解细菌，培养一段时间后，测定各组锥形瓶中秸秆减少量的平均值。该pH设置的不足之处有____________和____________。
答案 (1)腐烂稻草的土壤富含纤维素分解菌 (2)选择 (3)提供纤维素 纤维素分解菌的分解能力越强 (4)固定化细胞 (5)甘油管藏 (6)pH范围设置不合理 pH梯度设置不合理
解析 (3)要筛选到能产生纤维素酶的微生物，应使用选择培养基，在培养基中加入纤维素作为唯一碳源，能在此培养基中存活的微生物就是能产生纤维素酶的微生物，故滤纸的作用是提供纤维素。培养一段时间后，将残留的滤纸烘干称重，残留的滤纸越少，则说明纤维素分解菌的分解能力越强。
6．乳酸菌是对人体有益的微生物之一，常用于产生酸奶，其发酵产物为乳酸，能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙。为检测某品牌酸奶中的乳酸菌含量是否达标，检验人员进行了相关实验。回答下列问题：
(1)配制培养基：培养基中除含水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和______________。
(2)稀释样品：取1 mL待测酸奶，用______进行梯度稀释。
(3)接种培养：用______________法接种，培养时控制的气体条件是________________。
(4)观察计数：菌落周围出现____________的就是乳酸菌的菌落，选择菌落数在________的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是____________________________________。
答案 (1)CaCO3 (2)无菌水 (3)稀释涂布平板 无氧 (4)透明圈(或溶钙圈) 30～300 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
解析 (1)乳酸菌的发酵产物乳酸，能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙，因此配制培养乳酸菌的培养基除加入水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和CaCO3。(2)计数乳酸菌前，需用无菌水将待测酸奶稀释至合适浓度。(3)计数乳酸菌需用稀释涂布平板法接种，乳酸菌是厌氧菌，培养时控制的气体条件是无氧。(4)乳酸能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙，不透明的培养基上出现透明(溶钙)圈的就是乳酸菌的菌落。细菌计数时，常选择菌落数在30～300的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
7．(2020·合肥市质检)如图是纯化纤维素分解菌并生产乙醇的基本工作流程，请回答下列问题：
(1)图中①过程应选取富含纤维素的土壤，在鉴定和筛选所需微生物时需用________对纤维素进行染色并制成选择培养基，最后还要在平板培养基上分离纯化目的菌。为避免杂菌污染培养物和环境，接种时要在______________旁操作。
(2)图中②环节获得的酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，分别为C1酶、CX酶和______________。前两种酶使纤维素酶分解成____________，第三种酶将前两种酶的分解产物分解成葡萄糖。⑤环节常用的菌种是___________________________________________
_____________________________________________________________________________。
(3)用稀释涂布平板法测定一土壤样品中纤维素分解菌数量。在对应稀释倍数为106的稀释液中，取0.2 mL稀释液涂布，得到以下统计结果：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和246；请计算每毫升原液中的菌体数是______________。
答案 (1)刚果红 酒精灯火焰 (2)葡萄糖苷酶 纤维二糖 酵母菌 (3)1.16×109
解析 (1)分析题图可知，图中①过程表示纤维素分解菌的筛选，因此应选择富含纤维素的土壤，在鉴定和筛选所需微生物时需用刚果红对纤维素进行染色并制成选择培养基，最后还要在平板培养基上分离纯化目的菌。为避免杂菌污染培养物和环境，接种时要在酒精灯火焰旁操作。(2)从目的菌中得到的纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，分别为C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。⑤过程表示无氧发酵产生乙醇的过程，此过程常用的菌种是酵母菌。(3)涂布的三个平板上菌落的平均值为(210＋240＋246)/3＝232。原液中的菌体密度是232÷0.2×106＝1.16×109(个/mL)。
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