专题28 微生物的利用(选修1)教师版

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专题28微生物的利用
考点
知识内容
考试属性及要求
加试
一、微生物的利用
1.大肠杆菌的培养和分离
2.分离以尿素为氮源的微生物
掌握程度参考本考试标准中的：二、(二)
3.实验与探究能力

人们把那些形体微小(<0.1mm)，结构简单，在适宜环境下能生长繁殖及发生遗传变异，用肉眼难以看到，必须借助光学显微镜或电子显微镜才能看清的低等微小生物统称为微生物。绝大多数微生物与传染病无关，90%以上的微生物是对人类有利的。
真正理解原核生物、真核生物、病毒的隶属关系
生
物
非细胞
结构生物
病毒
如SARS病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)
亚病毒
类病毒
仅由RNA分子组成 如烟草花叶病毒(TMV)
朊病毒
由蛋白质组成，如疯牛病病原体
拟病毒、卫星病毒等
细胞
结构
生物
原核
生物
细菌
球菌、杆菌、螺旋菌 如大肠杆菌
蓝藻
如蓝球藻、念珠藻、颤藻
放线菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体、古细菌、原绿藻等
真核
生物
原生生物
单细胞植物
如衣藻
单细胞动物
如草履虫、变形虫
真菌
如酵母菌(共500多种)、霉菌、蕈菌(蘑菇、木耳、灵芝等)
植物
多细胞低等、高等植物
动物
多细胞低等、高等动物
一、微生物的实验室培养
1、培养基
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的培养基质。
成分：一般都含有 碳源、氮源、水和无机盐 ，还需要满足不同微生物生长对 PH 、特殊营养物质以及氧气的要求。
（2）有关培养基的类型及选择问题
划分标准
培养基种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如 琼脂
观察微生物的运动、分类鉴定
固体培养基
微生物分离 、鉴定 、活菌计数、保藏菌种
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)
分类、鉴别
用途
选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长
培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物，如用伊红－美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)

（3）培养基配制原则①目的明确：不同微生物需求不同，根据培养目的进行配制。②营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。③pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。对培养基pH的调节，需在 灭菌之前 进行。
（4）通常细菌培养基要用 蛋白胨 和 酵母提取物 来配制，还要加入一定量的 氯化钠 以维持一定的渗透压；霉菌的培养基一般用无机物配制或添加 蔗糖 的豆芽汁即可。
酸碱性：细菌要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长。
(磷酸二氢钾KH2PO4，溶于水，水溶液呈酸性。磷酸氢二钾K2HPO4，易溶于水，水溶液呈微碱性。)
（5）四类微生物的典型培养基及培养条件
微生物
类型
常用培养基
名称
最适pH
最适温
度(℃)
培养基成分及用量(1L培养基)
碳源(g)
氮源(g)
无机盐(g)
细
菌
自养细菌
(氧化硫杆菌)
化学合成
培养基
酸性
－－
空气
中的
二氧
化碳
硫酸铵0.4
粉状硫10
硫酸镁0.5
硫酸二氢钾4
硫酸亚铁0.01
氯化钙0.25
异养
细菌
牛肉膏
蛋白胨
7.0～7.2
30～37
牛肉膏5
蛋白胨10
氯化钠5
放
线
菌
淀粉培养基
(高氏培养基)
7.0～7.2
25～30
可溶性
淀粉20
硝酸钾1
硫酸氢二钾0.5
氯化钠0.5
硫酸镁0.5
硫酸亚铁0.01
马铃薯浸汁
自然pH
25～30
－－
－－
－－
酵母菌
麦芽汁
豆芽汁
4.6～6.0
25～30
－－
－－
－－
霉
菌
霉菌合成
培养基
(蔡氏培养基)
4.0～6.0
25～30
蔗糖30
硝酸钠3
硫酸氢二钾1
氯化钾0.5
硫酸镁0.5
硫酸亚铁0.01
马铃薯浸汁
豆芽汁
麦芽汁
－－
－－
－－
－－
－－
（6）牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备：计算→称量→熔化→调节PH→灭菌→ 倒平板
（7）倒平板的关键步骤：
①50℃左右开始倒平板：培养基经高压蒸汽灭菌锅灭菌后，需冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板。操作时使锥形瓶的瓶口经酒精灯火焰灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
②冷却后倒置原因：平板冷凝后培养皿的皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止培养皿的皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
③有时制成后的平板需倒掉：在倒平板的过程中，若将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。这样的平板最好不用而倒掉。
（倒板:一般15ml-20ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。保存:用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。）
2、无菌技术
（1）无菌技术的概念：指在医疗、护理和微生物培养操作中，防止一切微生物侵入人体以及防止无菌区和无菌物品被污染的操作技术。
（2）灭菌目的：为了获得纯净的培养物，关键是防止外来杂菌的污染。避免操作者自身被微生物感染。
（3）灭菌原理：针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物 蛋白质 凝固变性，从而达到杀菌的目的。
（4）无菌操作的条件：① 各种器皿必须是无菌的 ；② 各种培养基必须是无菌的 ；③ 细菌转移操作的过程必须是无菌的 。
（5）常见的消毒和灭菌方法
内容
种类
主要方法
应用范围
区别
联系
灭菌
灼烧
灭菌
酒精灯火焰灼
烧至烧红
微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或瓶口等
强烈的理化因素，能杀死物体内外包括芽孢 和孢子 在内的全部 微生物
①都需根据理化性质，营造微生物难以生存的不良环境
②其作用原理都是通过使蛋白质变性来抑制微生物生命活动或杀死微生物
干热
灭菌
干热灭菌箱
160～170℃
加热1～2h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适合用其他方法灭菌而又能耐高温的或需保持干燥的物品
高压蒸
汽灭菌
100kPa，121℃保持15～30min
培养基及多种器材、物品
(灭菌前各种物品均需要用牛皮纸或报纸包好；实验过程中不能用脱脂棉，易吸水引起污染)
消毒
巴氏
消毒法
在70～75℃煮30min或在80℃煮15min
牛奶 、啤酒 、果酒 和酱油 等不宜进行高温灭菌的液体
温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分 微生物(不包括芽孢和孢子)，是部分灭菌
煮沸
消毒法
100℃煮沸5～6min
(15～30min水蒸气)
日常食品、罐装食品
紫外线
消毒法
30W紫外灯
照射30min
接种室、接种箱、超净工作台
(操作者空间)(照射前可喷洒适量石炭酸或煤酚皂溶液等加强消毒效果)
化学
药物
消毒法
用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等；
氯气、石炭酸等化学药剂消毒法
操作者的衣着、皮肤、伤口、动植物组织表面、空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等；
实验者的双手用 70%的酒精 消毒；水源用 氯气 消毒。
3、微生物接种的常用方法



项目
划线分离法
涂布分离法
原理
通过 接种环 在琼脂固体培养基表面 连续划线 的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即 菌落 。
将菌液进行一系列的 梯度稀释 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
特点
方法 简单
单菌落更易分开，但操作 复杂 些
目的
在培养基上形成由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)。
4、细菌的分离方法：划线分离法和涂布分离法
划线分离法 用接种环蘸菌液后在含有 固体培养基 的培养皿平板上划线，使聚集的菌种分散到培养基的表面。经培养，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。在无菌操作下将单菌落接种到斜面上，每个斜面的菌落就是一个细菌产生的后代。
应用：用于基因工程的大肠杆菌等工程菌，可以用 划线分离法 获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有 抗性基因 （如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。
涂布分离法 先将培养的菌液 稀释 ，通常稀释到10-7－10-5倍，然后取0.1mL稀释度不同的稀释菌液加在培养皿的 固体培养基上，用 玻璃刮刀 涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的 菌落 。(玻璃刮刀在灼烧前，一般放于70%酒精的容器里。)
5、微生物数量的统计方法
常规的计数方法是 涂布分离法 和 显微镜直接计数法 。
（1） 涂布分离法
该法的基本原理：将待测含菌样品适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，然后取一定量的稀释样品液，接种到平板上。经过一定时间培养后，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。最后统计菌落数，根据其稀释倍数和取样量，换算出单位样品中所含的活菌数。
用涂布分离法计数时，为了保证结果准确，一般设置多于3个平板，选择菌落数在30－300的平板计数，并取平均数。做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度。对分解尿素的微生物计数时，一般制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液。
计算公式：每毫升的细菌数=平板上的菌落数x样品的稀释倍数(注：平板上的菌落来自1mL稀释液)
举例：稀释103倍的平板上有38个菌落，原培养物含有：38x1000=3.8x104个细菌细胞/mL
（2） 显微镜直接计算法
测定酵母细胞数或酶菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法，该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液，放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。
二、大肠杆菌的培养和分离
（1）大肠杆菌的特点：革兰氏 阴性 、兼性厌氧的肠道杆菌。
细菌的繁殖：以 分裂 的方式繁殖，分裂速度很快。
细菌的扩大培养：用 LB液体培养基 ；划线分离：用 LB固体平面培养基 。
（2）大肠杆菌的分离操作技术
最常用的方法是 划线分离法 ，其操作步骤是：
①培养基灭菌：将刚配制好的50mL LB液体培养基 和50mL LB固体培养基 分别装入两个250mL的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行 灭菌 。
②倒平板：在 酒精灯火焰 旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。
③接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的 液体培养基 中，三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床中震荡培养12h。
④划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿 倒置 ，放在37℃恒温培养箱中进行培养，12－24h后，可看到在划线的末端出现不连续的 单个菌落 ，表明菌已被分离。
⑤菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h后，置于 4℃ 冰箱中保存。
（3）大肠杆菌的培养与分离中应注意的问题
A.划线分离操作中的有关问题
①在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束后，仍然需要灼烧接种环。

第一次灼烧
每次划线之前灼烧
划线结束灼烧
目的
避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者
②在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线， 以避免接种环温度太高，杀死菌种 。
③在做第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始划线，能使细菌的数目随着划线 次数的增加而逐步减少 ，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
B.进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因
如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。
三、分离以尿素为氮源的微生物
（1）实验原理：不同微生物利用 氮源种类不同 。有一些细菌含有脲酶，通过降解尿素作为其生长的氮源。尿素在脲酶的降解下产生 NH3 ，使培养基的PH有原来的 中性 变为 碱性 ，于是培养基中的酚红由红黄色变成 红色 。(NH2)2C=O+H2O2NH3+CO2 本实验中， 酚红 作为酸碱指示剂添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4～8.2，在酸性下呈黄色，碱性下呈红色。
以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红由黄色变成红色，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
（2）实验步骤：
①制备培养基：在60℃左右时，将两个三角瓶中已灭菌的 LB固体培养基 和 尿素固体培养基 ，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，摇匀后平放至凝固。
②制备细菌悬液：在 无菌 条件下，将土样(从有哺乳动物排泄物的地方取得)1g加到有99mL无菌水的三角瓶中，震荡10min，即成10-2土壤稀释液，依此方法制备出10-3、10-4和10-5的土壤稀释液。
③涂布法分离：取0.1mL稀释10-4和10-5的土壤稀释液，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，用 灼烧法 灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布到整个平面上。
④培养和观察：在37℃恒温箱中培养24-48h，观察菌落数。
预测本实验的结果：LB全营养固体培养基上的菌落 多而杂 (对照组)；尿素固体培养基上的菌落少而纯 ，一定时间内，菌落周围出现红色区域。用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，更容易形成单菌落的是10-5土壤稀释液 。(图见P27)

尿素经过细菌过滤器(G6玻璃漏斗)灭菌后加入。
（1）用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。
（2）与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极小部分。
（3）实验结果与分析
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用
牛肉膏培养基上的菌落数目
大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一土样，统计结果应接近
注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当2个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
[诊断与思考]
(1)研究微生物的关键是防止杂菌入侵，获取纯净的培养物。(　√ )
(2)对于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基等要进行灭菌，而对实验操作空间、操作者的衣着等要进行消毒。(　√ )
(3)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。接种后的培养皿需放在光照培养箱中培养。(×)
(4)纯化菌株时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有划线分离法和涂布分离法。(　√ )
(5)在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。(　× )
(6)单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株最简便的方法之一。(　√ )
(7)接种环在每次转移菌株之前都需要进行高压蒸汽灭菌，以杀灭接种环上的杂菌。(　× )
(8)根据微生物对营养物质的需求，配制相应的培养基，如细菌喜荤，霉菌喜素，经高压蒸汽灭菌之后还要调节pH。(　× )
(9)有些化合物不能加热，如尿素等采用玻璃砂漏斗进行过滤灭菌，常用的有G5或G6玻璃砂漏斗。(　× )
(10)培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌。(　× )
(11)试管灭菌之前，管口一般需要封闭，以防止水分进入造成污染，常用封口膜或脱脂棉封口。(　× )
(12)打开超净台的紫外灯和过滤风后，实验者可在超净台上进行相应操作。(　× )
(13)划线分离后，需将培养皿倒置放入恒温培养箱，以防滴落的水滴造成菌落间污染无法形成单菌落。(√ )
(14)无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线分离法接种在斜面上，37℃培养24h后，可置于4℃冰箱中保存。(　√ )
(15)筛选微生物时要根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，如筛选分解尿素的细菌要用尿素作为唯一氮源。(　√ )
(16)用稀释涂布分解单菌落，一般各浓度做三个培养皿，每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。(√ )
(17)在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先进行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基上的细菌含量。(　×　)
(18)NH3遇酚红变红色，因此，培养基上会出现红色透明环带。(　√　)
(19)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是对分离的菌种作进一步的鉴定。(　√　)
(20)制备土壤悬液，需要用无菌水浸润土壤，然后从土壤稀释液底部取样。(　×　)
(21)稀释涂布所用的操作工具是玻璃刮刀，涂布前需在酒精灯火焰上灼烧，不用时要将其直接放在超净台上。(　×　)
(22)全营养培养基中有较多菌落，而尿素培养基上含有少量菌落，最可能的原因是全营养培养基被污染。(×)
(23)可利用固体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型。(　√　)
(24)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。(　×　)

1．在细菌培养过程中，有关操作正确的是（ ）
A.涂布器用火焰灼烧进行灭菌
B.培养基分装到培养皿后进行灭菌
C.倒平板和取菌液都必须要在酒精灯火焰旁进行
D.分离得到的菌落应先接种在平板上，培养24h后，置于4℃冰箱保存
解析 涂布器应该用高压蒸汽法灭菌，A错误；培养基应该先灭菌后分装，B错误；倒平板和取菌液都必须要在酒精灯火焰旁进行，以防止杂菌污染，C正确；分离得到的菌落应先接种后应该置于28℃的恒温箱培养24h，D错误。答案C。
2．下列有关划线分离法的操作错误的是（ ）
A.将接种环放在火焰上灼烧
B.将已冷却的接种环伸入菌液中只蘸取一次
C.蘸取菌液和划线要在火焰旁进行
D.划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连
答案D。
3．现有一升水样，梯度稀释至10-3倍。各取0.1mL已稀释10-3倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57个，则每升原水样中大肠杆菌数为（　　）个。
A．560 B．5.6×105 C．5.6×107 D．5.6×108
分析 每克样品中的菌落数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下的平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释的倍数。解答 题中梯度稀释的倍数是103，三个菌落的平均数=(55+56+57)/3=56，则每毫升样品中菌株数=56/0.1×103=5.6×105个，所以每升土壤浸出液中的菌株数=5.6×105×103=5.6×108个。故选：D
4．请回答微生物培养和分离的有关问题：
（1）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行     （填“消毒”或“灭菌”）；操作者的双手需要进行清洗和      （填“消毒”或“灭菌”）。若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过     （填“消毒”或“灭菌”）处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
（2）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是  。
（3）欲从土壤中分离出能利用尿素的细菌：以 为唯一氮源且加入了 指示剂的培养基，用
法分离细菌。若培养基平板上有菌落存活且颜色变       ，则说明分离成功。
（4）分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培养基，其成分（　　）
A．前者含琼脂，后者不含琼脂和琼脂糖
B．两者都含有琼脂
C．前者含有琼脂糖，后者不含琼脂糖但含琼脂
D．两者都不含琼脂和琼脂糖
（1）灭菌   消毒    灭菌    （2）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生     （3）尿素   酚红    涂布分离（或涂布）   红     （4）C
解析（1）灭菌是用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以对培养基和培养皿进行灭菌；消毒是用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，操作者的双手需要进行清洗和消毒。为了防止实验后的培养基污染环境，最好将培养基灭菌处理后丢弃。（2）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染，对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。（3）分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源，同时在培养基中加入酚红指示剂可用来鉴定分解尿素的细菌。若培养基平板上有菌落存活且颜色变红，则说明分离成功。（4）分离以尿素为氮源的细菌的培养基中含有琼脂糖，而分离大肠杆菌的培养基中不含琼脂糖但含琼脂这种凝固剂，所以选C。
5．下表是某同学设计的三组培养基：
组别
培养基
a
矿质元素、蔗糖、维生素、甘氨酸、水、琼脂
b
葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐、血清、水、琼脂
c
牛肉膏、蛋白胨、水、氯化钠、琼脂
（1）其中a组培养基可能用于培养___________________，但在分化阶段必须添加有关的_______________。
（2）用b组培养基可培养 ，但不需要添加 。
（3）用c组培养基可检验硬币上是否有细菌，培养一段时间后，可在此固体平板培养基上形成很多不同的____，从中选择不同的类型分别接种到固体培养基的试管斜面上，可用于分离细菌，这方法叫 。可用革兰氏染色的方法区分不同的细菌，用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色，这类细菌是 。如果想要大规模养这个菌种，一般可以在c组培养基上做什么调整？
。
（4）以上三种不同的培养基在用于培养之前都必须进行 操作，而且不同的培养基都必须有相应的适宜 。
（1）植物离体组织   植物激素
（2）动物细胞   琼脂
（3）菌落 划线分离法 革兰氏阳性菌 去掉配方中的琼脂
（4）灭菌   PH
解析（1）a组含有蔗糖、矿质元素等可以用来进行植物组织培养；在分化阶段需要加入生长素和细胞分裂素等植物激素，并控制好相互比例。
（2）b组含动物血清、葡萄糖等可以用来培养动物细胞；由于动物细胞培养时用的是液体培养基，不需要加入凝固剂——琼脂。
（3）细菌在固体培养基上培养时会繁殖形成很多不同的菌落。
（4）以上三种不同的培养基在用于培养之前都必须进行灭菌操作；而且不同的培养基都必须有相应的适宜pH，以适应不同生物细胞的生长需要。
6． 下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基，据表回答下列问题：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4•7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
自来水
1.4g
2.1g
0.3g
10.0g
1.0g
15.0g
定容至100mL
下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基，据表回答下列问题。
（1）该培养基中含有的最主要碳源是________________。该培养基除了能够提供碳源外，还可以提供                        。
（2）该培养基按物理性质划分属于___________培养基，该培养基具有选择作用的原因是 。
（3）在该培养基中，可以通过检测pH的变化来判断尿素是否被分解，所依据的原理是 。方法是在培养基中加入___________，若尿素被分解，则培养基变成_______色。
（4）如果将此培养基改为用来培养分离分解纤维素的微生物的培养基，则提供碳元素的物质应改为________________。
（1）葡萄糖   氮源、水和无机盐   
（2）固体    该培养基中唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能生长繁殖
（3）在分解尿素的过程中，微生物产生的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的PH升高   
  酚红指示剂     红     
（4）纤维素
7．下列关于分离以尿素为氮源的微生物实验操作中，不正确的是（ ）
A.将土壤样品用无菌水进行一系列的梯度稀释
B.同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C.对尿素固体培养基的灭菌应采用121℃(500g/cm2压力)的高压蒸汽灭菌法
D.若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
解析 尿素遇高温会分解，因此不能采用高压蒸汽灭菌法，应采用G6玻璃漏斗进行过滤。答案C。
8．某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其他特殊分析研究，其流程如图所示：
某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其特性分析研究，其流程如下图所示。请回答：

（1）土壤悬液首先经80℃处理15分钟，其目的是筛选出 。      
（2）在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行      ，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。培养后观察到       ，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与     强弱相关。
（3）筛选获得的菌株经鉴定后，将优良菌株进行液体扩大培养。培养时需要振荡，其主要目的是      。液体培养基与固体培养基相比不含有的成分是      。
（4）在合适条件下，将提纯的植酸酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球。该过程是对酶进行       。
A．吸附    B．包埋    C．装柱    D．洗涤
（5）温度与植酸酶相对酶活性的关系如图所示。下列叙述错误的是      。
A．测试温度中，固定化与非固定化植酸酶的最适温度分别为60℃和45℃
B．测试温度范围内，固定化植酸酶的相对酶活性波动低于非固定化植酸酶
C．固定化与非固定化植酸酶相比，相对酶活性在80%以上时的温度范围较宽
D．65℃时固定化与非固定化植酸酶的相对酶活性因蛋白质变性而位于最低点
（1）耐高温菌株 （2）稀释    单菌落     植酸酶的活性
（3）供氧    琼脂 （4）B （5）D
解析
（1）土壤悬液首先经80℃处理15分钟的目的是使大多数的不耐高温的微生物死亡而筛选出耐高温菌株。
（2）土壤悬液悬液在无菌条件下进行梯度稀释，使用稀释涂布平板法接种涂布于含有植酸钠的固体培养基上，经培养后可以观察到单菌落的出现，且出现透明圈，透明圈的直径大小与植酸酶的活性强弱相关。
（3）振荡培养的目的是向培养液供氧，同时使微生物与培养液充分接触，有利于微生物的繁殖与生长。液体培养基与固体培养基在物理性质上的主要区别是液体培养基不含凝固剂琼脂。
（4）固定化酶和固定化细胞的方法主要有包埋法、物理吸附法和化学结合法。题干所述方法是将提纯的植酸酶与海藻酸钠混合后，滴加到一定浓度的钙离子溶液中，使液滴形成凝胶固体小球，该过程属于包埋法。 故选B。
（5）据图分析，固定化与非固定化植酸酶的最适温度分别为60℃和45℃，A正确；图中，在测试温度范围内，固定化植酸酶的相对酶活性波动较小，低于非固定化植酸酶的波动，B正确；据图分析，固定化与非固定化植酸酶相比，相对酶活性在80%以上时的温度范围较宽，C正确；根据题意，植酸酶属于耐高温酶，65℃时固定化与非固定化植酸酶的相对酶活性不是因蛋白质变性而位于最低点，D错误。
9．根据分离以尿素为氮源的微生物实验，回答下列问题：
(1)写出脲酶降解尿素的反应式： 。
(2)该实验分离细菌时用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，更容易形成单菌落的是 。
(3)A同学筛选出的菌落为150个，其他同学只筛选出50个，并且他在设计实验时并没有设置对照。你认为A同学结果产生的原因可能有哪些？ 。 如何设计对照实验排除可能影响实验结果的因素：
。
(4)涂布平板的所有操作怎样保证无菌？
。
(5)有脲酶的细菌在生态稳定上起什么作用？
。
(1)CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2 (2)10-5土壤稀释液
(3)可能是土样不同，也可能是培养基污染或操作失误 方案有二：一是由其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果结果与A同学一致，则证明无误，如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基配制有问题；另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受污染。
(4)应从操作的各个细节保证“无菌”，都应在火焰附近进行。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、移液管头不要接触任何其他物质、移液管要在酒精灯火焰周围等。
(5)如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤碱化，氨还与其他阴离子物质如 SO42-、CO32-、NO3-等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。

琼脂为混合物，是植物胶的一种，用海产的石花菜、江蓠等制成，含少量氨化物，为无色、无固定形状的固体，溶于热水，可作冷食和细菌的培养基等；琼脂糖是琼脂加以纯化，去除含氮化合物而成为琼脂糖；琼脂和琼脂糖都可以作为凝固剂，用于制备固体培养基。

砂芯漏斗是一种耐酸玻璃滤过仪器，其采用优良硬质高硼玻璃组成，具有较高的理化性能。根据其孔径大小，分成G1到G6六种，滤板代号 孔径(μm) 一般用途如下：
G1 20~30 滤除粗沉淀物及胶状沉淀物
G2 10~15 滤除粗沉淀物及气体洗涤
G3 4.5~9 滤除细沉淀物，过滤水银
G4 3~4 滤除细沉淀或极细沉淀物
G5 1.5~2.5 滤除体积大的杆状细菌和酵母
G6 <1.5 滤除1.5~0.6 μm的病菌

巴氏消毒法：目前国际上通用的巴氏消毒法主要有两种：一种是将牛奶加热到62～65℃，保持30分钟。这一方法灭菌效率可达97.3%～99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌占多数的是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75～90℃，保温15～16s，其杀菌时间更短，工作效率更高。该方法能将病原菌杀死，但温度太高反而会有较多的营养损失。