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第三章《基因工程》（章节提升练）
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第三章 基因工程 章末练习 一、选择题 1．(2022·启东二模)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。据图分析下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析正确的是( ) A．提取DNA时可加入酒精，使不溶于酒精的蛋白质等物质析出 B．将提取的DNA溶于0.14 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定 C．用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现如图结果，说明未提取到质粒 D．溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响 解析：选D 提取DNA时可加入酒精，是为了让DNA析出，A错误；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定，B错误；用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现1条带，说明提取到环状质粒，C错误；溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，D正确。 2．(2022·衡水二模)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是( ) A．图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同 B．图1中X代表的碱基对数为4 500 C．推测图1中Y是限制酶B的酶切位点 D．推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 解析：选C 从图2的A＋B酶一组结果可知，限制酶A和B切割后总共有4个片段，碱基对数分别为500、1 500、3 500、4 500，而图1表示酶A和B切割时只会得到3个片段，碱基对数应该是3 500、X、2 000，结合图2中A＋B酶组结果可推测Y是限制酶A的酶切位点，X代表的碱基对数为4 500，B正确，C错误；根据以上结论，图1中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个碱基对数片段：3 500、(4 500＋1 500)、500，正好与图2的①结果相符，故推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同，A、D正确。 3．在研究拟南芥Q基因的功能时，获得了该基因T-DNA突变体，该突变体和野生型相比，对重金属镉(Cd)胁迫抗性明显增加。T-DNA中含有植物生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因，它们的表达与否能影响相应植物激素含量，进而调节肿瘤组织生长和分化。下列有关叙述错误的是( ) A．Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体DNA上的变异属于基因重组 B．该基因有可能编码一个根细胞膜的Cd2＋吸收转运载体蛋白质 C．可利用T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞染色体DNA中 D．可检测拟南芥肿瘤组织的生长和分化情况初步判断T-DNA是否转移 解析：选B Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体DNA上的过程发生基因重新组合，使得植物细胞具有T-DNA上的基因，该变异属于基因重组，A正确；与野生型相比，含该基因的突变体对重金属镉(Cd)胁迫抗性明显增加，说明突变体根细胞膜对Cd2＋吸收减少，说明该基因编码的不是Cd2＋吸收转运载体蛋白质，B错误；T-DNA又称为“可转移的DNA”，能转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA中，可利用T-DNA这一特性完成目的基因整合到受体细胞染色体DNA中，C正确；T-DNA中含有植物生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因，它们的表达与否能影响相应植物激素含量，进而调节肿瘤组织生长和分化，因此可检测拟南芥肿瘤组织的生长和分化情况初步判断T-DNA是否转移，D正确。 4．获得抗除草剂转基因玉米的技术流程如下图。下列相关叙述正确的是( ) A．玉米DNA聚合酶可识别报告基因启动子 B．将A自交可得到抗除草剂玉米纯合子 C．需用含四环素的培养基筛选愈伤组织 D．转化愈伤组织时需用氯化钙处理愈伤组织 解析：选B 玉米RNA聚合酶可识别报告基因启动子，A错误；除草剂抗性基因会插入到玉米的染色体DNA上，将A自交可得到抗除草剂玉米纯合子，B正确；需用含四环素的培养基筛选农杆菌，用含除草剂的培养基筛选愈伤组织，C错误；转化细菌时才需要氯化钙处理，D错误。 5．(2022·湖北华师附中模拟)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞(如图)。下列叙述错误的是( ) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 解析：选C 由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaB Ⅰ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，A正确；图中质粒与ACA-GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，D正确。 6．(2022·福州模拟)环境DNA(eDNA)技术是指从环境中提取DNA片段，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等，是一种新型生物资源调查手段。科学家采用该技术对某海域进行了物种信息普查研究，确认了该海域出现的布氏鲸的身份信息及相关海域的鱼类组成。下列叙述错误的是( ) A．区分不同鱼类时，不能选用tRNA、rRNA这样的结构 B．该技术可以针对可能存在的入侵物种设计引物，进行PCR和测序，对其进行早期监测 C．DNA技术只能用来调查目标区域的生物种类组成，不能用于评估生物数量的多少 D．利用该技术监测目标物种，是建立在知道该物种特有的基因序列的基础上 解析：选C tRNA、rRNA在结构和功能上比较保守，基本不发生变化，所以用tRNA、rRNA不能区别出不同的物种，应该选用不同物种的特有基因，A正确；PCR技术具有高度灵敏性，因此可以根据入侵物种的目的基因设计引物，然后进行PCR扩增，再通过凝胶电泳技术分析产物，如果有扩增产物，表明其中含有目的基因，则目标区域含有该入侵物种，B正确；eDNA是从环境样品中提取的DNA，由于DNA分子具有特异性，因此可以结合PCR技术和DNA测序技术检测生物种类，此外，也可以根据提取的同一物种的DNA数量推测生物数量的多少，C错误；利用该技术监测目标物种，需要根据该物种特有的基因序列设计引物，D正确。 7．将人抗体基因插入噬菌体DNA，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，表达的抗体可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附着在噬菌体表面，也可能通过大肠杆菌分泌出去。下列叙述错误的是( ) A．可从人的浆细胞中获取总RNA，通过逆转录PCR技术扩增出抗体基因 B．为防止抗体被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞 C．在把抗体基因导入受体细胞过程中，必须用Ca2＋处理大肠杆菌 D．通过该方法生产的抗体具有灵敏度高、特异性强的特点 解析：选C 产生抗体的基因在浆细胞中表达，可提取到相应的RNA，A正确；对于大肠杆菌来说，目的基因表达的抗体属于外来蛋白质，会被蛋白酶分解，因此应选择蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，B正确；由题意可知，以噬菌体DNA为载体，插入目的基因形成重组噬菌体，利用噬菌体的特性感染大肠杆菌，将目的基因运进受体细胞中，不需要用Ca2＋处理大肠杆菌，C错误；利用该方法生产的抗体种类单一、纯度高，因而具有灵敏度高、特异性强的特点，D正确。 8．下图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性内切核酸酶FoKⅠ两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKⅠ是一种形成二聚体后具有内切核酸酶活性的蛋白单体。下列相关叙述不正确的是( ) A．单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性 B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程 C．二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对 D．TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列 解析：选C FoKⅠ是非特异性内切核酸酶，单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性，A正确；TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术(扩增得到很多TALE基因)和蛋白质工程(对基因进行改造，得到很多蛋白质)，B正确；氨基酸内没有碱基，不能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对，只是存在恒定的对应关系，C错误；由于TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系，TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列，D正确。 9．我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”，该方法有多种操作方式。下图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是( ) A．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 解析：选D 农杆菌转化法只适用于双子叶植物，与农杆菌转化法相比，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育，A正确；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，而花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确；传粉过程需要在雌蕊成熟时，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。 10．人工基因驱动是以基因编辑技术为核心发展来的，可用于消灭携带疟疾的按蚊。决定野生型按蚊能携带疟原虫的基因组成为aa，科学家合成了使按蚊不能携带疟原虫的基因A。将由“A基因”“Cas9蛋白基因”和“可转录出sgRNA(可识别a基因的RNA序列)的基因”组成的基因驱动器转入野生型按蚊受精卵中，基因驱动器被整合到含a基因的同源染色体(1和1′)中的1上，使a基因改造成A基因，随后sgRNA识别并引导Cas9蛋白将1′上的a基因切除，切除部位的DNA会以1上同一位点未断裂的DNA为模板完成修复。下列说法错误的是( ) A．Cas9蛋白作用于双链DNA分子中特定部位的磷酸二酯键 B．经过人工基因驱动改造的野生型按蚊的基因型为Aa C．可利用显微注射将基因驱动器注入野生型按蚊受精卵中 D．若人工基因驱动中的目的基因使按蚊只能繁衍雄性后代，则一段时间后按蚊物种将灭绝 解析：选B 由题意可知，Cas9蛋白的作用是将1′上的a基因切除，所以Cas9蛋白作用于双链DNA分子中特定部位的磷酸二酯键，A正确；决定野生型按蚊能携带疟原虫的基因组成为aa，且“基因驱动器被整合到含a基因的同源染色体(1和1′)中的1上，使a基因改造成A基因，随后sgRNA识别并引导Cas9蛋白将1′上的a基因切除，切除部位的DNA会以1上同一位点未断裂的DNA为模板完成修复”，所以经过人工基因驱动改造的野生型按蚊的基因型为AA，B错误；通过显微注射法可将基因表达载体导入受体细胞中，所以可利用显微注射将基因驱动器注入野生型按蚊受精卵中，C正确；若人工基因驱动中的目的基因使按蚊只能繁衍雄性后代，那么一段时间后按蚊中无雌性个体，所以一段时间后按蚊物种将灭绝，D正确。 二、非选择题 11．(2022·青岛模拟)杜氏肌营养不良症(DMD)是单基因遗传病，此病会造成患者全身肌肉退化。研究发现大约13%DMD患者的致病基因D在外显子45和50之间区域有突变(真核生物基因的编码区中对应成熟RNA的序列被称为外显子，每个基因有多个外显子)，这会使外显子51及之后的序列表达异常，从而阻止正常D蛋白产生。研究人员为探索DMD的临床治疗方案，对一种DMD模型犬进行基因编辑。该DMD模型犬缺失外显子50(△Ex50)导致外显子51中出现终止密码子对应序列。研究人员利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对DMD模型犬外显子51进行切割，以期跳过外显子51，产生一个缩短但仍有功能D蛋白，如图1。 (1)DMD的变异类型属于__________。研究还发现，不同DMD患者的D基因可在不同位置发生碱基替换、重复或缺失，说明此类变异具有____________________的特点。 (2)CRISPR/Cas9复合体由两部分组成，一部分是可以切割基因的“手术刀”Cas9蛋白，另一部分是gRNA。由图1推知，Cas9蛋白断开的化学键是__________，gRNA的主要功能是__________________________________________________。 (3)将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒注射进DMD模型犬的骨骼肌中，6周后进行检测，结果如图2。图中结果为___________________________________________；肌肉检测发现，基因编辑犬的肌肉萎缩症状明显减轻。综上说明____________________。 (4)研究人员的最终目的是修正全身的肌肉组织，通过静脉注射将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒运送到全身，CRISPR/Cas9相应DNA序列需使用肌肉特异性启动子驱动表达，原因是_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)由题意可知，DMD的变异类型属于基因突变。不同DMD患者的D基因可在不同位置发生碱基替换、重复或缺失，说明此变异类型具有随机性和不定向性的特点。(2)Cas9蛋白是切割基因的“手术刀”，类似于限制酶，因此Cas9蛋白可催化DNA分子中磷酸二酯键的断裂；据图1可知，gRNA的主要功能是通过碱基互补配对原则特异性结合目标DNA序列。(3)实验操作为“将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒注射进DMD模型犬的骨骼肌中”，结合柱形图可知，该实验的自变量为不同类型的犬(正常犬、DMD模型犬和基因编辑犬)，DMD模型犬 (△Ex50)肌肉组织的D蛋白含量很低，基因编辑犬的D蛋白表达量显著高于DMD模型犬，但低于正常犬；若基因编辑犬的肌肉萎缩症状明显减轻，说明D蛋白表达有助于缓解肌肉萎缩症状。(4)静脉注射后CRISPR/Cas9相应DNA序列可随血液流动运送到全身各处；为使CRISPR/Cas9表达系统只在肌肉组织细胞中发挥作用，避免伤害到其他细胞的基因组，CRISPR/Cas9相应DNA序列需使用肌肉特异性启动子驱动表达。 答案：(1)基因突变 随机性和不定向性 (2)磷酸二酯键 通过碱基互补配对原则特异性结合目标DNA序列 (3)DMD模型犬 (△Ex50)肌肉组织的D蛋白含量很低，基因编辑犬的D蛋白表达量显著高于DMD模型犬，但低于正常犬 D蛋白表达有助于缓解肌肉萎缩症状 (4)使静脉注射的CRISPR/Cas9表达系统只在肌肉组织细胞中发挥作用，避免伤害到其他细胞的基因组 12．(2022·北京四中模拟)突变体是研究功能基因组的前提，转座子是基因组中可以移动的 DNA 序列。科研人员将玉米转座子进行改造，改造后的 Ac 转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力。Ds 转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，只有同时存在 Ac 和Ds 时，Ds 才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复。现将玉米转座子引入到水稻的 DNA 中，构建水稻突变体库，并从中筛选到稳定遗传的矮秆突变株，实验流程如下图所示。 请回答下列问题： (1)科研人员将Ac 和 Ds 分别导入水稻细胞，获得 Ac 和Ds 的转化植株，流程如下。 ①首先将构建的 Ac 转座载体和Ds 转座载体分别与__________混合培养。 ②取水稻未成熟种子，消毒后接种于含有________________________(答两类物质)以及碳源、氮源、水、无机盐等的培养基上，诱导产生愈伤组织。因愈伤组织具有__________特点，常作为基因工程的理想受体。 ③将完成转化的愈伤组织接种于含有________的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即 F0。 (2)为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选 T-DNA单拷贝插入，但没有表型突变的Ac 和 Ds 转基因植株 F0，杂交获得 F1。通过 PCR 技术从中筛选出目标 F1植株(转座子插入法构建的突变体库中的植株)，理论上目标F1植株占 F1个体总数的______。请从下图中任选一种目标F1________(填“A”或“B”)，画出其相应亲本 F0植株的基因组成及在染色体的位置。 (3)目标 F1植株自交获得F2，可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体，理由是________________________________________________________________。研究发现有些发生转座的植株并没有表型的变化，请分析原因__________________________(写出两种)。 (4)科研人员在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有 Ds 而无 Ac 的植株，目的是____________________________________________________________，并用Ds作标签在基因组中定位且分离出矮秆基因。 解析：(1)①由题图分析可知，图中构建的基因表达载体用到了Ti质粒，据此推测导入受体细胞选择的是农杆菌转化法，因此首先将构建的Ac转座载体和Ds转座载体分别与农杆菌混合培养。②植物组织培养的培养基属于固体培养基，需要添加凝固剂琼脂，其中除了含有植物激素起调节作用外，还需要添加一定的营养物质，包括蔗糖、维生素类、无机盐、水等，诱导产生愈伤组织。愈伤组织是高度液泡化、无定形状态的薄壁组织团块，因此其具有分化程度低、分裂能力强的特点，常作为基因工程的理想受体材料。③由题图分析可知，构建的基因表达载体中都含有潮霉素抗性基因作为标记基因，因此完成转化的愈伤组织细胞具有潮霉素抗性，可以将其接种于含有潮霉素的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即F0。(2)根据题意可知，为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选T-DNA单拷贝插入，但没有表型突变的Ac和Ds转基因植株F0，即只有Ac插入到一条染色体上的植株F0和只有Ds插入到另外一条染色体(与Ac插入染色体为同源染色体或非同源染色体上)上的植株F0，则植株F0的基因型如图： (分别插入到不同植株的非同源染色体上)或 (分别插入到不同植株的同源染色体上)，二者杂交获得F1，通过PCR技术从中筛选出目标F1植株(转座子插入法构建的突变体库中的植株)，则F1植株的基因型为：，那么理论上目标F1植株占F1个体总数的1/4。(3)由题图分析可知，构建的含有Ds基因的表达载体中，Ds基因插入到除草剂抗性基因中，转化得到植株F0后，经过杂交筛选得到目标F1植株，根据题意，同时存在Ac和Ds时，Ds才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复，因此目标F1植株自交获得F2，Ds未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在Ds发生转座后，除草剂抗性基因才会表达，故可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体。根据以上分析和基因突变与性状的关系可知，发生转座的植株的表型可以没有发生变化，其原因可能有①Ds插入基因之间的序列，不影响基因的表达；②Ds插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；③Ds插入基因的非编码区；④Ds插入基因的编码序列中，但没有改变编码功能蛋白质的核心氨基酸序列；⑤插入Ds的基因，其功能可通过基因网络的其他路径得以实现。⑥某些基因需要外界环境的刺激，才能产生应答表型；⑦Ds插入的基因是在细胞中未表达的基因；⑧Ds插入某显性基因使其发生隐性突变，植株由显性纯合子变为杂合子。(4)根据题意，Ac转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力，Ds转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有Ds而无Ac的植株，则该植株的Ds基因不能转移，可以使矮秆突变的性状稳定遗传。 答案：(1)①农杆菌 ②植物激素、琼脂 分化程度低 ③潮霉素 (2)1/4 A或B 如图所示 13．人参皂苷Rh2是人参中重要的活性组分之一，具有抗肿瘤和免疫调节等功能。我国科研人员以酵母菌为受体细胞，经改造获得Rh2前体物质A高产的L菌株。科研人员对其继续进行基因工程改造，以期获得人参皂苷Rh2高产的细胞工厂菌株。 (1)相比于植物细胞，选择酵母菌作为受体细胞的主要优势是__________________________________________________________________(答出3点即可)。 (2)前体物质A可依次经过P酶和N酶转化为人参皂苷Rh2。科研人员通过__________方法获得大量P和N基因片段，然后再用限制酶和__________酶处理，将他们连接形成重组DNA片段。科研人员将基因编辑质粒、引导序列质粒和重组DNA片段导入L菌。据图1分析，为初步筛选得到成功转入两种质粒的受体菌，需要用____________________的培养基。再通过分子水平技术确定重组DNA片段整合到L菌染色体上。 (3)科研人员筛选得到成功转化的R菌株，将其与L菌株置于相同条件下培养，发酵一段时间后检测人参皂苷Rh2和前体物质A的含量，结果如下图。据图分析，R菌株能______________________________。 (4)结合上述研究，在此基础上进一步提升R菌株生产能力的可行方案是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)选择酵母菌作为受体细胞的优点有繁殖快、细胞遗传物质相对较少、易培养、产物含量高、产物易分离。(2)大量获得目的基因的方法是采用PCR技术，构建基因表达载体需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶，根据图示分析，表达载体上含色氨酸合成酶基因和尿素合成酶基因，含有表达载体的受体菌能在无色氨酸和尿素的培养基上生长，其他细菌不能生长，故用不含色氨酸和尿素的培养基将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。(3)据图分析，转化成功的R菌，与标准参考对照，R菌的曲线的特点是曲线上的峰值和对照组大致相同，故能合成人参皂苷Rh2和前体物质A。(4)据图分析，R菌能合成人参皂苷Rh2和前体物质A，但前体物质A的含量的峰值较低，根据上述分析，综合研究，其方案为提取L菌的合成前体物质A的基因，构建基因表达载体并导入R菌内，筛选人参皂苷Rh2和前体物质A合成量都较高的目的R菌，然后扩大培养。 答案：(1)繁殖快、细胞遗传物质相对较少、易培养、产物含量高、产物易分离(答3点即可) (2)PCR扩增 DNA连接 不含尿素和色氨酸 (3)能合成人参皂苷Rh2和前体物质A (4)提取L菌的合成前体物质A基因，构建基因表达载体并导入R菌内，筛选人参皂苷Rh2和前体物质A合成量都较高的目的R菌，然后扩大培养 (3)Ds未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在Ds发生转座后，除草剂抗性基因才会表达 ①Ds插入基因之间的序列，不影响基因的表达；②Ds插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；③Ds插入基因的非编码区；④Ds插入的基因是在细胞中未表达的基因；⑤Ds插入某显性基因使其发生隐性突变，植株由显性纯合子变为杂合子 (4)使矮秆突变的性状可以稳定遗传(或避免Ds再次切离转座) 14．蜘蛛丝具有良好的机械性能，有广泛的应用前景。我国科学家利用基因工程技术成功在家蚕丝腺和蚕茧中大量表达蜘蛛丝蛋白。回答下列问题： (1)PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因：____________________________________________________________；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术________(填“可以”或“不可以”)为目的基因设置酶切位点。 (2)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号)。①升高复性温度 ②降低复性温度 ③重新设计引物 (3)构建基因表达载体时(如图1所示)，需要在目的基因前后两端分别引入__________的酶切位点，该方法比用同一种酶进行酶切的优势是______________________________(答出一点即可)。 (4)研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，因而设计了与蛛丝蛋白基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了一个碱基)，并按如图2所示方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛛丝蛋白基因。 ①改良蛛丝蛋白的技术属于________工程。 ②图中所示的4次PCR都涉及到引物的选择，其中PCR1选择的引物是______(填“A”“B”“C”或“D”)，PCR4选择的引物是______(填“A”“B”“C”或“D”)。 解析：(1)DNA合成需要引物与模板链结合，若引物之间能碱基互补配对，则引物之间可能会结合形成双链，降低了引物与DNA模板链结合的效率；PCR是体外扩增DNA的技术，在引物中添加酶切位点，可以在几次循环后得到含有酶切位点的DNA片段。(2)PCR反应得不到任何扩增产物，原因很多，可能是由于引物不合适，或者复性温度过高，引物无法结合，则可以采取的改进措施有降低复性温度和重新设计引物，故选②③。(3)图1中一共有3个酶切位点，而Hind Ⅲ的酶切位点在标记基因内，若用Hind Ⅲ进行酶切会破坏标记基因，因此选用XbaⅠ和SacⅠ；使用两种不同的酶分别对目的基因和质粒进行酶切，会形成不同的黏性末端，目的基因自身不能环化也不会反接，提高构建重组表达载体的成功率。(4)改良蛛丝蛋白的技术属于蛋白质工程；DNA新链合成的方向为5′→3′，即引物的方向为5′→3′，结合图示PCR1的产物可知，使用的引物为A、B；PCR4结束后得到的是完整的长段DNA，结合引物的方向为5′→3′，因此选用的是A、D两种引物。 答案：(1)防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率 可以 (2)②③ (3)XbaⅠ和SacⅠ 防止目的基因自身环化，防止目的基因反向连接等 (4)①蛋白质 ②A、B A、D
第三章 基因工程 章末练习 一、选择题 1．(2022·启东二模)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。据图分析下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析正确的是( ) A．提取DNA时可加入酒精，使不溶于酒精的蛋白质等物质析出 B．将提取的DNA溶于0.14 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定 C．用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现如图结果，说明未提取到质粒 D．溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响 解析：选D 提取DNA时可加入酒精，是为了让DNA析出，A错误；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定，B错误；用限制酶Ⅰ和Ⅱ分别处理提取的产物，电泳出现1条带，说明提取到环状质粒，C错误；溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，D正确。 2．(2022·衡水二模)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是( ) A．图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同 B．图1中X代表的碱基对数为4 500 C．推测图1中Y是限制酶B的酶切位点 D．推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 解析：选C 从图2的A＋B酶一组结果可知，限制酶A和B切割后总共有4个片段，碱基对数分别为500、1 500、3 500、4 500，而图1表示酶A和B切割时只会得到3个片段，碱基对数应该是3 500、X、2 000，结合图2中A＋B酶组结果可推测Y是限制酶A的酶切位点，X代表的碱基对数为4 500，B正确，C错误；根据以上结论，图1中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个碱基对数片段：3 500、(4 500＋1 500)、500，正好与图2的①结果相符，故推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同，A、D正确。 3．在研究拟南芥Q基因的功能时，获得了该基因T-DNA突变体，该突变体和野生型相比，对重金属镉(Cd)胁迫抗性明显增加。T-DNA中含有植物生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因，它们的表达与否能影响相应植物激素含量，进而调节肿瘤组织生长和分化。下列有关叙述错误的是( ) A．Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体DNA上的变异属于基因重组 B．该基因有可能编码一个根细胞膜的Cd2＋吸收转运载体蛋白质 C．可利用T-DNA的特性将目的基因整合到受体细胞染色体DNA中 D．可检测拟南芥肿瘤组织的生长和分化情况初步判断T-DNA是否转移 解析：选B Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体DNA上的过程发生基因重新组合，使得植物细胞具有T-DNA上的基因，该变异属于基因重组，A正确；与野生型相比，含该基因的突变体对重金属镉(Cd)胁迫抗性明显增加，说明突变体根细胞膜对Cd2＋吸收减少，说明该基因编码的不是Cd2＋吸收转运载体蛋白质，B错误；T-DNA又称为“可转移的DNA”，能转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA中，可利用T-DNA这一特性完成目的基因整合到受体细胞染色体DNA中，C正确；T-DNA中含有植物生长素合成酶基因和细胞分裂素合成酶基因，它们的表达与否能影响相应植物激素含量，进而调节肿瘤组织生长和分化，因此可检测拟南芥肿瘤组织的生长和分化情况初步判断T-DNA是否转移，D正确。 4．获得抗除草剂转基因玉米的技术流程如下图。下列相关叙述正确的是( ) A．玉米DNA聚合酶可识别报告基因启动子 B．将A自交可得到抗除草剂玉米纯合子 C．需用含四环素的培养基筛选愈伤组织 D．转化愈伤组织时需用氯化钙处理愈伤组织 解析：选B 玉米RNA聚合酶可识别报告基因启动子，A错误；除草剂抗性基因会插入到玉米的染色体DNA上，将A自交可得到抗除草剂玉米纯合子，B正确；需用含四环素的培养基筛选农杆菌，用含除草剂的培养基筛选愈伤组织，C错误；转化细菌时才需要氯化钙处理，D错误。 5．(2022·湖北华师附中模拟)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞(如图)。下列叙述错误的是( ) A．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因 B．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞即为成功转入目的基因的细胞 D．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 解析：选C 由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaB Ⅰ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，A正确；图中质粒与ACA-GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，避免反向连接，B正确；在含卡那霉素的培养基上能存活的植物细胞为成功转入目的基因的细胞或含有普通质粒的细胞，C错误；PCR技术可用于基因探针的制备，可用来检测目的基因是否导入受体细胞，D正确。 6．(2022·福州模拟)环境DNA(eDNA)技术是指从环境中提取DNA片段，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等，是一种新型生物资源调查手段。科学家采用该技术对某海域进行了物种信息普查研究，确认了该海域出现的布氏鲸的身份信息及相关海域的鱼类组成。下列叙述错误的是( ) A．区分不同鱼类时，不能选用tRNA、rRNA这样的结构 B．该技术可以针对可能存在的入侵物种设计引物，进行PCR和测序，对其进行早期监测 C．DNA技术只能用来调查目标区域的生物种类组成，不能用于评估生物数量的多少 D．利用该技术监测目标物种，是建立在知道该物种特有的基因序列的基础上 解析：选C tRNA、rRNA在结构和功能上比较保守，基本不发生变化，所以用tRNA、rRNA不能区别出不同的物种，应该选用不同物种的特有基因，A正确；PCR技术具有高度灵敏性，因此可以根据入侵物种的目的基因设计引物，然后进行PCR扩增，再通过凝胶电泳技术分析产物，如果有扩增产物，表明其中含有目的基因，则目标区域含有该入侵物种，B正确；eDNA是从环境样品中提取的DNA，由于DNA分子具有特异性，因此可以结合PCR技术和DNA测序技术检测生物种类，此外，也可以根据提取的同一物种的DNA数量推测生物数量的多少，C错误；利用该技术监测目标物种，需要根据该物种特有的基因序列设计引物，D正确。 7．将人抗体基因插入噬菌体DNA，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，表达的抗体可能和病毒蛋白以融合蛋白的形式，附着在噬菌体表面，也可能通过大肠杆菌分泌出去。下列叙述错误的是( ) A．可从人的浆细胞中获取总RNA，通过逆转录PCR技术扩增出抗体基因 B．为防止抗体被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞 C．在把抗体基因导入受体细胞过程中，必须用Ca2＋处理大肠杆菌 D．通过该方法生产的抗体具有灵敏度高、特异性强的特点 解析：选C 产生抗体的基因在浆细胞中表达，可提取到相应的RNA，A正确；对于大肠杆菌来说，目的基因表达的抗体属于外来蛋白质，会被蛋白酶分解，因此应选择蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，B正确；由题意可知，以噬菌体DNA为载体，插入目的基因形成重组噬菌体，利用噬菌体的特性感染大肠杆菌，将目的基因运进受体细胞中，不需要用Ca2＋处理大肠杆菌，C错误；利用该方法生产的抗体种类单一、纯度高，因而具有灵敏度高、特异性强的特点，D正确。 8．下图是一种靶向基因敲除技术即TALEN技术。该技术的敲除工具是由DNA识别域TALE和非特异性内切核酸酶FoKⅠ两个部分组成的蛋白质。TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系。FoKⅠ是一种形成二聚体后具有内切核酸酶活性的蛋白单体。下列相关叙述不正确的是( ) A．单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性 B．TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术和蛋白质工程 C．二连氨基酸能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对 D．TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列 解析：选C FoKⅠ是非特异性内切核酸酶，单独使用FoKⅠ对基因的切割敲除具有随机性，A正确；TALE蛋白的合成通常涉及PCR技术(扩增得到很多TALE基因)和蛋白质工程(对基因进行改造，得到很多蛋白质)，B正确；氨基酸内没有碱基，不能与四种含氮碱基发生恒定的碱基互补配对，只是存在恒定的对应关系，C错误；由于TALE的二连氨基酸(字母N、I、G、H、D分别代表一种氨基酸)与四种碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系，TALE蛋白左右臂的二连氨基酸序列的设计依据靶基因碱基序列，D正确。 9．我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”，该方法有多种操作方式。下图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是( ) A．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育 B．相比于农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作 C．必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法 D．外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达 解析：选D 农杆菌转化法只适用于双子叶植物，与农杆菌转化法相比，花粉管通道法还适用于玉米等单子叶植物的转基因培育，A正确；花粉管通道法可以直接实现转基因植物的自然生成，而农杆菌转化法还需要对成功导入目的基因的受体细胞进行植物组织培养获得转基因植物，而花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作，B正确；传粉过程需要在雌蕊成熟时，因此，花粉管通道法也应该必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建重组载体才能实现，外源DNA也需要构建基因表达载体，才能借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。 10．人工基因驱动是以基因编辑技术为核心发展来的，可用于消灭携带疟疾的按蚊。决定野生型按蚊能携带疟原虫的基因组成为aa，科学家合成了使按蚊不能携带疟原虫的基因A。将由“A基因”“Cas9蛋白基因”和“可转录出sgRNA(可识别a基因的RNA序列)的基因”组成的基因驱动器转入野生型按蚊受精卵中，基因驱动器被整合到含a基因的同源染色体(1和1′)中的1上，使a基因改造成A基因，随后sgRNA识别并引导Cas9蛋白将1′上的a基因切除，切除部位的DNA会以1上同一位点未断裂的DNA为模板完成修复。下列说法错误的是( ) A．Cas9蛋白作用于双链DNA分子中特定部位的磷酸二酯键 B．经过人工基因驱动改造的野生型按蚊的基因型为Aa C．可利用显微注射将基因驱动器注入野生型按蚊受精卵中 D．若人工基因驱动中的目的基因使按蚊只能繁衍雄性后代，则一段时间后按蚊物种将灭绝 解析：选B 由题意可知，Cas9蛋白的作用是将1′上的a基因切除，所以Cas9蛋白作用于双链DNA分子中特定部位的磷酸二酯键，A正确；决定野生型按蚊能携带疟原虫的基因组成为aa，且“基因驱动器被整合到含a基因的同源染色体(1和1′)中的1上，使a基因改造成A基因，随后sgRNA识别并引导Cas9蛋白将1′上的a基因切除，切除部位的DNA会以1上同一位点未断裂的DNA为模板完成修复”，所以经过人工基因驱动改造的野生型按蚊的基因型为AA，B错误；通过显微注射法可将基因表达载体导入受体细胞中，所以可利用显微注射将基因驱动器注入野生型按蚊受精卵中，C正确；若人工基因驱动中的目的基因使按蚊只能繁衍雄性后代，那么一段时间后按蚊中无雌性个体，所以一段时间后按蚊物种将灭绝，D正确。 二、非选择题 11．(2022·青岛模拟)杜氏肌营养不良症(DMD)是单基因遗传病，此病会造成患者全身肌肉退化。研究发现大约13%DMD患者的致病基因D在外显子45和50之间区域有突变(真核生物基因的编码区中对应成熟RNA的序列被称为外显子，每个基因有多个外显子)，这会使外显子51及之后的序列表达异常，从而阻止正常D蛋白产生。研究人员为探索DMD的临床治疗方案，对一种DMD模型犬进行基因编辑。该DMD模型犬缺失外显子50(△Ex50)导致外显子51中出现终止密码子对应序列。研究人员利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对DMD模型犬外显子51进行切割，以期跳过外显子51，产生一个缩短但仍有功能D蛋白，如图1。 (1)DMD的变异类型属于__________。研究还发现，不同DMD患者的D基因可在不同位置发生碱基替换、重复或缺失，说明此类变异具有____________________的特点。 (2)CRISPR/Cas9复合体由两部分组成，一部分是可以切割基因的“手术刀”Cas9蛋白，另一部分是gRNA。由图1推知，Cas9蛋白断开的化学键是__________，gRNA的主要功能是__________________________________________________。 (3)将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒注射进DMD模型犬的骨骼肌中，6周后进行检测，结果如图2。图中结果为___________________________________________；肌肉检测发现，基因编辑犬的肌肉萎缩症状明显减轻。综上说明____________________。 (4)研究人员的最终目的是修正全身的肌肉组织，通过静脉注射将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒运送到全身，CRISPR/Cas9相应DNA序列需使用肌肉特异性启动子驱动表达，原因是_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)由题意可知，DMD的变异类型属于基因突变。不同DMD患者的D基因可在不同位置发生碱基替换、重复或缺失，说明此变异类型具有随机性和不定向性的特点。(2)Cas9蛋白是切割基因的“手术刀”，类似于限制酶，因此Cas9蛋白可催化DNA分子中磷酸二酯键的断裂；据图1可知，gRNA的主要功能是通过碱基互补配对原则特异性结合目标DNA序列。(3)实验操作为“将带有CRISPR/Cas9相应DNA序列的腺病毒注射进DMD模型犬的骨骼肌中”，结合柱形图可知，该实验的自变量为不同类型的犬(正常犬、DMD模型犬和基因编辑犬)，DMD模型犬 (△Ex50)肌肉组织的D蛋白含量很低，基因编辑犬的D蛋白表达量显著高于DMD模型犬，但低于正常犬；若基因编辑犬的肌肉萎缩症状明显减轻，说明D蛋白表达有助于缓解肌肉萎缩症状。(4)静脉注射后CRISPR/Cas9相应DNA序列可随血液流动运送到全身各处；为使CRISPR/Cas9表达系统只在肌肉组织细胞中发挥作用，避免伤害到其他细胞的基因组，CRISPR/Cas9相应DNA序列需使用肌肉特异性启动子驱动表达。 答案：(1)基因突变 随机性和不定向性 (2)磷酸二酯键 通过碱基互补配对原则特异性结合目标DNA序列 (3)DMD模型犬 (△Ex50)肌肉组织的D蛋白含量很低，基因编辑犬的D蛋白表达量显著高于DMD模型犬，但低于正常犬 D蛋白表达有助于缓解肌肉萎缩症状 (4)使静脉注射的CRISPR/Cas9表达系统只在肌肉组织细胞中发挥作用，避免伤害到其他细胞的基因组 12．(2022·北京四中模拟)突变体是研究功能基因组的前提，转座子是基因组中可以移动的 DNA 序列。科研人员将玉米转座子进行改造，改造后的 Ac 转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力。Ds 转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，只有同时存在 Ac 和Ds 时，Ds 才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复。现将玉米转座子引入到水稻的 DNA 中，构建水稻突变体库，并从中筛选到稳定遗传的矮秆突变株，实验流程如下图所示。 请回答下列问题： (1)科研人员将Ac 和 Ds 分别导入水稻细胞，获得 Ac 和Ds 的转化植株，流程如下。 ①首先将构建的 Ac 转座载体和Ds 转座载体分别与__________混合培养。 ②取水稻未成熟种子，消毒后接种于含有________________________(答两类物质)以及碳源、氮源、水、无机盐等的培养基上，诱导产生愈伤组织。因愈伤组织具有__________特点，常作为基因工程的理想受体。 ③将完成转化的愈伤组织接种于含有________的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即 F0。 (2)为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选 T-DNA单拷贝插入，但没有表型突变的Ac 和 Ds 转基因植株 F0，杂交获得 F1。通过 PCR 技术从中筛选出目标 F1植株(转座子插入法构建的突变体库中的植株)，理论上目标F1植株占 F1个体总数的______。请从下图中任选一种目标F1________(填“A”或“B”)，画出其相应亲本 F0植株的基因组成及在染色体的位置。 (3)目标 F1植株自交获得F2，可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体，理由是________________________________________________________________。研究发现有些发生转座的植株并没有表型的变化，请分析原因__________________________(写出两种)。 (4)科研人员在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有 Ds 而无 Ac 的植株，目的是____________________________________________________________，并用Ds作标签在基因组中定位且分离出矮秆基因。 解析：(1)①由题图分析可知，图中构建的基因表达载体用到了Ti质粒，据此推测导入受体细胞选择的是农杆菌转化法，因此首先将构建的Ac转座载体和Ds转座载体分别与农杆菌混合培养。②植物组织培养的培养基属于固体培养基，需要添加凝固剂琼脂，其中除了含有植物激素起调节作用外，还需要添加一定的营养物质，包括蔗糖、维生素类、无机盐、水等，诱导产生愈伤组织。愈伤组织是高度液泡化、无定形状态的薄壁组织团块，因此其具有分化程度低、分裂能力强的特点，常作为基因工程的理想受体材料。③由题图分析可知，构建的基因表达载体中都含有潮霉素抗性基因作为标记基因，因此完成转化的愈伤组织细胞具有潮霉素抗性，可以将其接种于含有潮霉素的培养基进行筛选，培养后获得抗性植株，即F0。(2)根据题意可知，为了便于对转座突变体的功能基因进行研究和定位，筛选T-DNA单拷贝插入，但没有表型突变的Ac和Ds转基因植株F0，即只有Ac插入到一条染色体上的植株F0和只有Ds插入到另外一条染色体(与Ac插入染色体为同源染色体或非同源染色体上)上的植株F0，则植株F0的基因型如图： (分别插入到不同植株的非同源染色体上)或 (分别插入到不同植株的同源染色体上)，二者杂交获得F1，通过PCR技术从中筛选出目标F1植株(转座子插入法构建的突变体库中的植株)，则F1植株的基因型为：，那么理论上目标F1植株占F1个体总数的1/4。(3)由题图分析可知，构建的含有Ds基因的表达载体中，Ds基因插入到除草剂抗性基因中，转化得到植株F0后，经过杂交筛选得到目标F1植株，根据题意，同时存在Ac和Ds时，Ds才能以一定的频率从原位点切离插入到任意新位点中，同时使功能基因得以破坏或恢复，因此目标F1植株自交获得F2，Ds未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在Ds发生转座后，除草剂抗性基因才会表达，故可在苗期喷洒除草剂筛选转座突变体。根据以上分析和基因突变与性状的关系可知，发生转座的植株的表型可以没有发生变化，其原因可能有①Ds插入基因之间的序列，不影响基因的表达；②Ds插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；③Ds插入基因的非编码区；④Ds插入基因的编码序列中，但没有改变编码功能蛋白质的核心氨基酸序列；⑤插入Ds的基因，其功能可通过基因网络的其他路径得以实现。⑥某些基因需要外界环境的刺激，才能产生应答表型；⑦Ds插入的基因是在细胞中未表达的基因；⑧Ds插入某显性基因使其发生隐性突变，植株由显性纯合子变为杂合子。(4)根据题意，Ac转座子能够合成转座酶，但是由于缺失两端的转座序列而丧失转移能力，Ds转座子不能合成转座酶，因此单独存在时也不能发生转移，在众多转座突变体中发现一矮秆突变株，让其自交并筛选仅含有Ds而无Ac的植株，则该植株的Ds基因不能转移，可以使矮秆突变的性状稳定遗传。 答案：(1)①农杆菌 ②植物激素、琼脂 分化程度低 ③潮霉素 (2)1/4 A或B 如图所示 13．人参皂苷Rh2是人参中重要的活性组分之一，具有抗肿瘤和免疫调节等功能。我国科研人员以酵母菌为受体细胞，经改造获得Rh2前体物质A高产的L菌株。科研人员对其继续进行基因工程改造，以期获得人参皂苷Rh2高产的细胞工厂菌株。 (1)相比于植物细胞，选择酵母菌作为受体细胞的主要优势是__________________________________________________________________(答出3点即可)。 (2)前体物质A可依次经过P酶和N酶转化为人参皂苷Rh2。科研人员通过__________方法获得大量P和N基因片段，然后再用限制酶和__________酶处理，将他们连接形成重组DNA片段。科研人员将基因编辑质粒、引导序列质粒和重组DNA片段导入L菌。据图1分析，为初步筛选得到成功转入两种质粒的受体菌，需要用____________________的培养基。再通过分子水平技术确定重组DNA片段整合到L菌染色体上。 (3)科研人员筛选得到成功转化的R菌株，将其与L菌株置于相同条件下培养，发酵一段时间后检测人参皂苷Rh2和前体物质A的含量，结果如下图。据图分析，R菌株能______________________________。 (4)结合上述研究，在此基础上进一步提升R菌株生产能力的可行方案是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)选择酵母菌作为受体细胞的优点有繁殖快、细胞遗传物质相对较少、易培养、产物含量高、产物易分离。(2)大量获得目的基因的方法是采用PCR技术，构建基因表达载体需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶，根据图示分析，表达载体上含色氨酸合成酶基因和尿素合成酶基因，含有表达载体的受体菌能在无色氨酸和尿素的培养基上生长，其他细菌不能生长，故用不含色氨酸和尿素的培养基将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。(3)据图分析，转化成功的R菌，与标准参考对照，R菌的曲线的特点是曲线上的峰值和对照组大致相同，故能合成人参皂苷Rh2和前体物质A。(4)据图分析，R菌能合成人参皂苷Rh2和前体物质A，但前体物质A的含量的峰值较低，根据上述分析，综合研究，其方案为提取L菌的合成前体物质A的基因，构建基因表达载体并导入R菌内，筛选人参皂苷Rh2和前体物质A合成量都较高的目的R菌，然后扩大培养。 答案：(1)繁殖快、细胞遗传物质相对较少、易培养、产物含量高、产物易分离(答3点即可) (2)PCR扩增 DNA连接 不含尿素和色氨酸 (3)能合成人参皂苷Rh2和前体物质A (4)提取L菌的合成前体物质A基因，构建基因表达载体并导入R菌内，筛选人参皂苷Rh2和前体物质A合成量都较高的目的R菌，然后扩大培养 (3)Ds未发生转座时除草剂抗性基因不能正常表达，只有在Ds发生转座后，除草剂抗性基因才会表达 ①Ds插入基因之间的序列，不影响基因的表达；②Ds插入基因的内含子区域，无突变表型的出现；③Ds插入基因的非编码区；④Ds插入的基因是在细胞中未表达的基因；⑤Ds插入某显性基因使其发生隐性突变，植株由显性纯合子变为杂合子 (4)使矮秆突变的性状可以稳定遗传(或避免Ds再次切离转座) 14．蜘蛛丝具有良好的机械性能，有广泛的应用前景。我国科学家利用基因工程技术成功在家蚕丝腺和蚕茧中大量表达蜘蛛丝蛋白。回答下列问题： (1)PCR是获取大量目的基因的一种方法，PCR反应体系的成分中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链，对两种引物的设计要求之一是：两种引物之间不能碱基互补配对，试分析原因：____________________________________________________________；从引物设计的角度考虑，如果目的基因两侧没有酶切位点，用PCR技术________(填“可以”或“不可以”)为目的基因设置酶切位点。 (2)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号)。①升高复性温度 ②降低复性温度 ③重新设计引物 (3)构建基因表达载体时(如图1所示)，需要在目的基因前后两端分别引入__________的酶切位点，该方法比用同一种酶进行酶切的优势是______________________________(答出一点即可)。 (4)研究人员发现若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，蛛丝韧性可提高50%，因而设计了与蛛丝蛋白基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了一个碱基)，并按如图2所示方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛛丝蛋白基因。 ①改良蛛丝蛋白的技术属于________工程。 ②图中所示的4次PCR都涉及到引物的选择，其中PCR1选择的引物是______(填“A”“B”“C”或“D”)，PCR4选择的引物是______(填“A”“B”“C”或“D”)。 解析：(1)DNA合成需要引物与模板链结合，若引物之间能碱基互补配对，则引物之间可能会结合形成双链，降低了引物与DNA模板链结合的效率；PCR是体外扩增DNA的技术，在引物中添加酶切位点，可以在几次循环后得到含有酶切位点的DNA片段。(2)PCR反应得不到任何扩增产物，原因很多，可能是由于引物不合适，或者复性温度过高，引物无法结合，则可以采取的改进措施有降低复性温度和重新设计引物，故选②③。(3)图1中一共有3个酶切位点，而Hind Ⅲ的酶切位点在标记基因内，若用Hind Ⅲ进行酶切会破坏标记基因，因此选用XbaⅠ和SacⅠ；使用两种不同的酶分别对目的基因和质粒进行酶切，会形成不同的黏性末端，目的基因自身不能环化也不会反接，提高构建重组表达载体的成功率。(4)改良蛛丝蛋白的技术属于蛋白质工程；DNA新链合成的方向为5′→3′，即引物的方向为5′→3′，结合图示PCR1的产物可知，使用的引物为A、B；PCR4结束后得到的是完整的长段DNA，结合引物的方向为5′→3′，因此选用的是A、D两种引物。 答案：(1)防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率 可以 (2)②③ (3)XbaⅠ和SacⅠ 防止目的基因自身环化，防止目的基因反向连接等 (4)①蛋白质 ②A、B A、D
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