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2023年高考真题和模拟题生物分项汇编（全国通用）专题18 基因工程（解析版）
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这是一份2023年高考真题和模拟题生物分项汇编（全国通用）专题18 基因工程（解析版），共41页。试卷主要包含了单选题，综合题等内容，欢迎下载使用。
专题18 基因工程
一、单选题
1．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
1．B
【分析】分析题图：AT1蛋白通过抑制PIP2s蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1蛋白缺陷，可以提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；
C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。
故选B。
2．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2．B
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；
D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。
故选B。
3．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
3．C
【分析】1、DNA分子复制的过程：
①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。
②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。
③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构。从而形成2个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子。
2、限制酶和DNA聚合酶作用的对象都是磷酸二酯键。
【详解】A、由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；
B、填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B正确；
C、DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；
D、癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。
故选C。
4．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
4．D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
5．（2023·广东·统考高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
5．D
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选D。
6．（2023·广东·统考高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA分子）通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下列叙述错误的是（ ）
A．p53基因突变可能引起细胞癌变
B．p53蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
6．C
【分析】人和动物细胞中的DNA上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、p53基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A正确；
B、p53基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B正确；
C、依据题意，circDNMT1通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变快，C错误；
D、circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D正确。
故选C。
7．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
7．C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
二、综合题
8．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
8．(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
9．（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是_________。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是________。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为 ）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为_________（写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为________bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为_____mg.d-1。
9．(1)常染色体隐性遗传病 1/32
(2) 5'-TAAGGT-3' 8和302
(3)4
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
【详解】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1与I-2均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的女儿Ⅱ-4患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2和Ⅱ-3关于乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1和I-2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩增引物应为两基因共有的TAAGGT。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8和2+293+7=302bp,突变甲基因无法被酶切，故不写。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）Ⅲ-2关于乙的基因型为-/-，有患NTDs的可能，因此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为4mg·d-1。
10．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。
10．(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3)将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
11．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞）_______（填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对_______和_______生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_________。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_________。
11．(1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
12．（2023·北京·统考高考真题）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
(1)我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是___________。
(2)科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→___________→电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为___________条。
(3)油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大规模种植成为可能。品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，由此可大量繁殖A。在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来提高种子S的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1生产种子S的育种流程见图丙。
①图丙中，A植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1杂交，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为_______________。
②为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，简单易行的田间操作用____________________________。
12．(1)黄化叶
(2)用限制酶B处理 3
(3) 50% 在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。
【详解】（1）野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，由此可以推测黄化叶是隐性性状。
（2）检测F2基因型的实验步骤为：：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型基因电泳结果有一条带，叶黄化的基因电泳结果有两条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
（3）①油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），设育性基因为A、a，叶色基因为B、b，可判断雄性不育品系A为显性纯合子（AA），R为隐性纯合子（aa），A植株的绿叶雄性不育子代（AaBb）与黄化A1（aabb）杂交，后代中一半黄化，一半绿叶，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为50%。
②A不纯会影响种子S的纯度，为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，应在开花前把田间出现的绿叶植株除去。
13．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。
13．(1)负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2)基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
14．（2023·全国·统考高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。
14．(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。
②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
15．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_____。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_____。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取_____进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_____。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_____
15．(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2)筛选 RNA聚合酶
(3)核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
16．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
16．(1)再生 叶
(2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用
(3)同一个杂种融合原生质体 ABD
(4)再分化 根和芽
(5)模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
17．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
17．(1)野生型
(2)运载体 启动子和终止子
(3)DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
一、单选题
1．（2023·河南新乡·校考模拟预测）下列关于生物学实验的叙述中，不正确的是（ ）
A．在“观察洋葱根尖有丝分裂”和“观察细胞中RNA和DNA分布”的实验中加入盐酸的目的有所不同
B．在色素的提取和分离实验中，叶绿素b在层析液中的溶解度最低，扩散速度最慢
C．双缩脲试剂和斐林试剂的化学成分相同，只是个别物质的浓度不同
D．制取细胞膜和提取DNA都可以用鸡血作为实验材料
1．D
【分析】1、在“观察洋葱根尖有丝分裂”的实验中加入质量分数为15%的HCl溶液和95%的酒精溶液按1：1体积比的比例混合成解离液；“观察细胞中DNA和RNA分布”的实验中加入盐酸的质量浓度为8%和目的为能够改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，同时使染色质中的DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合；
2、斐林试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05 g/mL的硫酸铜溶液，要现配现用，斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化为：砖红色（沉淀）；双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 g/mL的硫酸铜溶液，双缩脲试剂鉴定蛋白质时，要先用双缩脲试剂A试剂与蛋白质混合后，再用B试剂，才可产生紫色反应。
【详解】A、在“观察洋葱根尖有丝分裂”实验中盐酸的作用是解离，“观察细胞中DNA和RNA分布”的实验中盐酸的作用是改变细胞膜通透性和使DNA与蛋白质分离开，A正确；
B、在色素的提取和分离实验中，胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，叶绿素b的溶解度最低，B正确；
C、据分析可知，双缩脲试剂和斐林试剂的化学成分相同，主要是NaOH和CuSO4，用法不同，它们物质的浓度也不同，C正确；
D、制备细胞膜不能用鸡血作材料，因为有其他膜的干扰，制备细胞膜时用哺乳动物的红细胞在材料，D错误。
故选D。
2．（2023·广东汕头·金山中学校考三模）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（ ）
A．分子运输车-载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等
B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸互补链
C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D．含目的基因的植物受体细胞可能无需培养成完整植株
2．D
【分析】基因工程技术的基本步骤是：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，A正确；
B、若利用PCR技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶延伸子链，B错误；
C、接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，C错误；
D、为了大量生产人血清白蛋白，可从愈伤组织获得，无需培养为完整植株，D正确。
故选D。
3．（2023·河北·统考模拟预测）基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接形成基因表达载体。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理（如表所示），其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因载体经酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是（ ）
分组
相应酶切处理
甲
限制酶H1
乙
限制酶H2
丙
限制酶H1+H2
A．该基因载体最有可能为环状DNA分子
B．限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点
C．限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0.2kb
D．限制酶作用于该载体时会直接导致氢键和磷酸二酯键的断裂
3．D
【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。
【详解】A、由图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；
B、当用一种限制酶切割载体时，产生的DNA片段等长，而用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在该载体上都有酶切位点，B正确；
C、用两种限制酶同时切割载体时，产生0.6kb和0.2kb两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距0.2kb，C正确；
D、限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
故选D。
4．（2023·广东梅州·统考三模）以菜花为材料提取DNA时，需将材料进行研磨，研磨液的成分常含有SDS(蛋白质变性剂)、EDTA(DNA酶抑制剂，稳定DNA活性)、Tris(缓冲剂)。下列有关叙述错误的是（ ）
A．若选择鸡血细胞为材料，则省去了研磨过程
B．SDS可以使蛋白质变性，便于DNA与蛋白质分离
C．EDTA可以防止DNA水解成核糖核苷酸
D．Tris可以调节溶液中的pH
4．C
【分析】提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
【详解】A、鸡血细胞悬浮液作为实验材料，利用细胞吸水涨破的原理，省去了研磨过程，A正确；
B、SDS是蛋白质变性剂，可使蛋白质结构变得松散，使染色体中DNA和蛋白质分离，B正确；
C、DNA的基本单位是脱氧核苷酸，EDTA是DNA酶抑制剂，可以防止DNA水解成脱氧核苷酸，C错误；
D、Tris是缓冲剂，可调节溶液中的pH，D正确。
故选C。
5．（2023·山东·山东师范大学附中校考模拟预测）下列关于基因工程及其应用的叙述，错误的是（ ）
A．花粉管通道法可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
B．只要从转基因棉花中检测到Bt抗虫蛋白，就代表转基因抗虫棉培育成功
C．Bt抗虫蛋白被分解为多肽后与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔
D．干扰素是一种糖蛋白，科学家用基因工程方法从大肠杆菌细胞内获得了干扰素
5．B
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①通过PCR技术检测目的基因是否插入待测生物体内以及是否转录出相应的RNA；②利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质；③个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、我国科学家用独创的花粉管通道法将Bt基因导入棉花细胞，如可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中，A正确；
B、从转基因棉花中检测到Bt抗虫蛋白，还需要进行个体生物学鉴定才能说明转基因抗虫棉是否培育成功，B错误；
C、Bt抗虫蛋白被分解成多肽后，多肽与某类昆虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，因而能破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，C正确；
D、干扰素是一种糖蛋白，科学家利用大肠杆菌代谢旺盛的特点，用基因工程方法从大肠杆菌细胞内获得了干扰素，D正确。
故选B。
6．（2023·北京·北大附中校考模拟预测）研究者对绿色荧光蛋白进行改造，将其第203位苏氨酸替换为酪氨酸，使改造后的蛋白质在特定光激发后发射橙色光，称为橙色荧光蛋白。关于橙色荧光蛋白的构建，以下说法正确的是（ ）
A．用蛋白酶直接处理绿色荧光蛋白获得目标产物
B．设计定点突变PCR获得橙色荧光蛋白基因
C．PCR扩增获得的产物激发后可以发橙色荧光
D．绿色荧光蛋白基因发生的突变类型为碱基缺失
6．B
【分析】基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变。蛋白酶催化蛋白质中肽键的水解，使蛋白质分解成小分子氨基酸。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过改造基因或合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，这种技术最终只能通过操作基因来完成。
【详解】A、用蛋白酶直接处理绿色荧光蛋白得到的是各种氨基酸，而不是第203位苏氨酸替换为酪氨酸的橙色荧光蛋白，A错误；
B、要使绿色荧光蛋白第203位苏氨酸替换为酪氨酸，可以通过对其基因进行定点突变PCR实现，这样基因中控制苏氨酸的碱基序列替换为合成酪氨酸的碱基序列，B正确；
C、PCR扩增获得的产物是目的基因片段，不能发橙色荧光，只有该基因片段控制合成的蛋白质才会在激发后发橙色荧光，C错误；
D、绿色荧光蛋白基因发生的突变类型为碱基替换，D错误。
故选B。
7．（2023·广东·广州市第二中学校联考模拟预测）蛋白质的空间结构是生命科学研究领域的热点内容。某科研团队利用人工智能AI开发的AlphaFold2程序对大部分蛋白质结构的预测极为精准。下列叙述错误的是（ ）
A．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
B．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础
C．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程
D．结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制
7．A
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】A、由于一种氨基酸可能有多种密码子，因此新蛋白质的氨基酸序列推出的基因序列不止一种，A错误；
B、氨基酸脱水缩合形成多肽，多肽盘曲折叠形成具有一定空间结构的蛋白质。因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，B正确；
C、蛋白质工程能通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，C正确；
D、人工智能程序AlphaFold2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，因此结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，D正确。
故选A。
8．（2023·山东菏泽·山东省鄄城县第一中学校考三模）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图）．利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B．sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D．通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
8．D
【分析】CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。
【详解】AB、Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，AB正确；
C、复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，C正确；
D、通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。
故选D。
9．（2023·海南海口·海南华侨中学校考一模）环境DNA（eDNA）是“在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合”，它涵盖的范围非常广泛，无论是土壤、空气、液体，甚至是排泄物，都可以从中找到可作为样品的eDNA。下列有关说法正确的是（ ）
A．A-T和G-C两种碱基对排列在eDNA的内侧构成基本骨架
B．脱氧核糖和磷酸的排列顺序决定了eDNA结构具有多样性和特异性
C．PCR扩增微量的样品eDNA利用的原理是DNA半保留复制
D．eDNA获取的生物信息不可用于动物种群的监测、管理和保护
9．C
【分析】DNA分子结构的主要特点：DNA是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的双螺旋结构；DNA的外侧由脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架，内侧是碱基通过氢键连接形成的碱基对，碱基之间的配对遵循碱基互补配对原则（A-T、C-G）。
【详解】A、脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成DNA的基本骨架，A错误；
B、碱基对排列顺序的千变万化，构成了DNA分子的多样性，碱基对的特定排列顺序，又构成了每一个DNA分子的特异性，B错误；
C、PCR是一项体外扩增DNA的技术，故扩增微量的样品eDNA利用的原理是DNA半保留复制，C正确；
D、环境DNA（eDNA）技术是一种新型生物资源调查手段，是指从环境中提取DNA片段，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等，故eDNA获取的生物信息可用于动物种群的监测、管理和保护，D错误。
故选C。
10．（2023·湖南娄底·校联考模拟预测）基因通常是具有遗传效应的DNA片段。下列关于真核生物基因的描述，不正确的是（ ）
A．真核生物的胰岛素基因在一定条件下可以在细菌细胞中表达
B．基因表达的最终产物大都是承担细胞相应生命活动的蛋白质
C．刚转录完成的RNA序列与结合到核糖体上的该基因的mRNA序列不同
D．某组织细胞中全部的mRNA 逆转录出的DNA包含该生物所有的基因
10．D
【分析】1、DNA的结构：①由两条、反向平行的脱氧核苷酸链盘旋成双螺旋结构。②外侧：脱氧核糖和磷酸交替连接构成基本骨架。内侧：由氢键相连的碱基对组成。③碱基配对有一定规律：A=T，G≡C。（碱基互补配对原则）。
2、基因的概念：基因是具有遗传效应的DNA片段，是决定生物性状的基本单位。
3、基因和染色体的关系：基因在染色体上，并且在染色体上呈线性排列，染色体是基因的主要载体。
【详解】A、由中心法则可知，所有生物共用一套遗传密码，真核生物的基因在一定条件下是可以在原核细胞中表达的，如转入人胰岛素基因的细菌，A 正确；
B、基因表达的最终产物大都是蛋白质并承担细胞相应功能，也有一些基因表达产物就是RNA 并直接参与生命活动，如RNA类酶、tRNA 等，B正确；
C、真核基因刚转录完成的mRNA 需要剪切加工，成为成熟mRNA 后结合到核糖体上开始翻译，C正确；
D、某组织细胞中全部的mRNA是由该细胞在分化过程中，部分基因表达产生的，由该细胞的全部的mRNA逆转录出的DNA仅包含该细胞已表达的基因，只是该生物所含基因的一部分，D错误。
故选D。
二、多选题
11．（2023·山东烟台·统考模拟预测）红细胞生成素（EPO）是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列有关叙述正确的是（ ）
A．构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的下游
B．一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达
C．用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中可合成并提取EPO
D．用PCR扩增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
11．ABD
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心，包括启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点等，启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】A、启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，故构建表达载体时需将EPO基因（目的基因）插入乳腺蛋白基因的启动子的下游，A正确；
B、某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO，所以一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达，B正确；
C、用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的受精卵（将来发育成雌性个体）中，待其发育到一定阶段，方可合成EPO，C错误；
D、用PCR扩增人EPO基因，前提是需要一段已知的EPO基因核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，D正确。
故选ABD。
12．（2023·江苏扬州·统考三模）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD) 替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG) ，可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A．转入的 L -PG 基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B．L-PG 基因替换质粒上的 PD 基因是通过同源重组实现的
C．标记基因A m pr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D．可以利用 PCR 技术筛选含有 L-PG 基因的受体细胞
12．ABD
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、由图可知，通过基因工程技术实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因，基因工程的实质是基因重组，B正确；
C、标记基因Amp可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
13．（2023·江西·江西省宜春市第一中学校联考模拟预测）冠状病毒家族S蛋白胞内半胱氨酸富集区（CRD）是S蛋白介导膜融合和病毒感染所必需的保守功能域，为探究CRD是否可作为新型药物干预靶点，研究人员根据对蛋白质功能的特定需求，采取与S蛋白竞争性抑制思路，最终设计合成了一种穿膜多肽 S-CRD（由三种短肽融合组成），S-CRD 对不同突变型的新冠病毒作用效果如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．不同突变型新冠病毒的遗传物质彻底水解产物相同
B．S-CRD的制备可以通过改造或合成基因来实现
C．CRD结构域可能成为研发广谱抗冠状病毒药物的新型干预靶点
D．S-CRD通过直接抑制RNA复制来抑制病毒增殖，且抑制效果与浓度有关
13．ABC
【分析】蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。
【详解】A、不同突变型新冠病毒的遗传物质都是RNA，彻底水解的产物是相同的，A正确；
B、设计合成一种穿膜多肽S-CRD属于蛋白质工程，需要通过改造或合成基因来实现，B正确；
C、从图中看出加入CRD后，变异株的RNA复制量降低，说明该物质可以抑制病毒的增殖，且随着浓度的增加，抑制作用增强，所以可能成为研发广谱抗冠状病毒药物的新型干预靶点，C正确；
D、根据题干信息“冠状病毒家族S蛋白胞内半胱氨酸富集区（CRD）是S蛋白介导膜融合和病毒感染所必需的保守功能域，而采取与S蛋白竞争性抑制思路，最终设计合成了一种穿膜多肽S-CRD”，说明CRD是和S蛋白竞争相应的位点，而不是直接抑制RNA复制来抑制病毒增殖，D错误。
故选ABC。
三、综合题
14．（2023·江苏盐城·盐城中学校考模拟预测）党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯是我国重要的粮食作物之一。致病疫霉导致的晚疫病及干旱、高低温和盐胁迫等是导致马铃薯减产的重要原因。研究人员为探究StNPR4和tproNPR4基因在马铃薯应对致病疫霉和高盐胁迫中的功能进行了相关实验，基因表达载体构建示意图如下。
(1)用SacⅡ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR－L16质粒用___________酶连接，构建重组pENTR－L16。
(2)经____________酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
(3)将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是____________法，它利用了T－DNA的____________特性，最终使目的基因整合到马铃薯细胞____________上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。下图A表示马铃薯基因相对表达量分析，B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150mmol·L-1的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，**表示组别间差异达到极显著水平。
①据图A分析，只有转基因品系____________的表达量显著低于野生型（WT）和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
②据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的优势是具有_____________，致病疫霉相对生物量低：生根率高，____________。
(4)为研究转基因马铃薯植株的分子机理，研究人员利用Taqman探针和反转录PCR技术，对转基因马铃薯StproNPR4和StNPR4基因的表达进行检测：
①StproNPR4基因的两端碱基序列如下：
采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5'－CTTGGATGAT－3'，则引物1的序列为____________（标出5'和3’端，写出前6个碱基即可）。
②Tagman探针的结构如图所示，由于探针有_____________的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。在PCR过程中，Taq酶体现出_____________酶活性，在相同扩增时间中，总荧光值与待测基因的_____________成正比。
③经检测，转基因马铃薯水杨酸（SA）信号通路相关蛋白基因表达量显著上升，SA是一种植物抗病有关的调节物质。研究人员推测L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，欲验证这一假设，需要进行的实验是____________。
14．(1)DNA连接
(2)SacⅡ和Kpn1
(3)农杆菌转化 可转移 染色体的DNA 5 抗病性 存活能力强
(4) 5'－TCTGTT－3' 碱基互补配对 DNA聚合 mRNA（转录）量 敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）用SacⅡ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR－L16质粒具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接，构建重组pENTR－L16。
（2）分析题图可知，两个质粒都有SacⅡ和Kpn1的酶切位点，故经SacⅡ和Kpn1酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
（3）将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是农杆菌转化法，T－DNA是可转移DNA，能够最终使目的基因整合到马铃薯细胞染色体的DNA上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。
①A表示马铃薯基因相对表达量分析，据图A分析，只有转基因品系5的表达量显著低于野生型（WT）和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
②B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150mmol·L·的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，图中的**表示组别间差异达到极显著水平。据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的致病疫霉相对生物量低，说明具有抗病性；而生根率高，故干旱条件下存活能力强。
（4）引物需要与模板链的3'端互补配对，即-OH端，故根据StproNPR4基因两端碱基序列可知，采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5'－CTTGGATGAT－3'，则引物1的序列为5'－TCTGTT－3'。
②依据Tagman探针的结构图可知，由于探针有碱基互补配对的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。在PCR过程中，Taq酶体现出DNA聚合酶活性，然后，在延伸过程中，DNA 聚合酶启动聚合并对引物执行 5' → 3' 核酸外切酶活性。DNA 聚合酶将荧光素和猝灭剂分开。然后，游离荧光素发出荧光。 故在相同扩增时间中，总荧光值与待测基因的mRNA（转录）量成正比。
③分析题意，实验目的为验证L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，自变量为有无SA途径，故欲验证这一假设，需要进行的实验是敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况。
15．（2023·广东·广州市第二中学校联考模拟预测）人血清白蛋白（HISA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母困基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是四种不同的限制酶，具各目识别的酶切位点如表所示。请回答：
限制酶
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
识别序列及切割位点
(1)工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、______、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，其中，______是该工程的中心环节。
(2)利用PCR技术扩增HSA基因需要引物，设计引物的原则是______。（答出两点即可）
(3)科研人员将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶______进行共同切割，原因是______（答出2点即可）。
(4)构建的基因表达载体中需要使用酵母菌蛋白基因的启动子AOX，原因是______。将受体酵母菌置于含有____的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
15．(1)培养基的配制、灭菌 发酵
(2)与模板链碱基互补配对，引物之间或引物内部不能互补配对，引物长度通常为20-30个核苷酸
(3) Ⅱ、Ⅳ 质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点；使用限制酶Ⅰ会使质粒的启动子丢失或标记基因被破坏；使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接
(4) AOX有利于HAS基因在酵母菌细胞内的表达 四环素
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）发酵工程的内容包括菌种选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。发酵工程的中心环节是发酵过程。
（2）PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物之间或引物内部不能互补配对，用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸；引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）图中四环素抗性基因中含有酶切位点Ⅰ，氨苄青霉素抗性基因中含有I、Ⅱ、Ⅳ三种酶切位点，质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点；使用限制酶Ⅰ会使质粒的启动子丢失或标记基因被破坏；使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接，因此将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶Ⅱ、Ⅳ进行共同切割。
（4）启动子是RNA聚合酶识别、结合的位点，是启动转录的位点，在构建基因表达载体时添加酵母菌蛋白基因的启动子AOX，有利于目的基因（HSA基因）在酵母菌细胞内表达。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶Ⅱ、Ⅳ进行共同切割，氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因未被破坏，故筛选时可将受体酵母菌置于含有四环素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
16．（2023·河北沧州·校考模拟预测）如图A所示，质粒上含有X抗生素抗性基因（）和Y抗生素抗性基因（），其中内部含有限制酶KasI的识别序列，内部含有限制酶Fse I、Hpa II、Nae I、NgoM IV的识别序列，五种酶的识别序列如表格所示（表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。
(1)若要将图B所示的目的基因直接插入到内形成重组质粒，则质粒需用限制酶___________切开。将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后连接，一般先用___________处理大肠杆菌后，再对其进行导入操作。
名称
说别序列及切期位点
名称
识别序列及规割位点
Fse I
Hpa II
KasI
Nae I
NgoM IV
(2)取导入处理过的大肠杆菌接种到含有抗生素___________（填“X”或“Y”）的培养基中培养，培养基___________（填“需要”或“不需要”）加入琼脂。从获得的纯培养物中取部分菌体接种到含有抗生素___________（填“X”或“Y”）的培养基中，若无菌落生长，可初步确定获得的培养物符合要求；若有菌落生长，原因是___________。
(3)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插人目的基因的重组质粒（图C所示），拟设计引物进行PCR鉴定。图C所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，若选择引物___________进行PCR，且扩增出了450 bp片段，则说明实验成功；若选择引物甲、乙进行PCR，且扩增出了400bp片段，原因是___________。
16．(1) NgoM IV
(2) X 需要 Y 质粒重新环化或质粒间发生自身环化，使得大肠杆菌同时具备基因XR和YR
(3)甲和丙 目的基因反向连接
【分析】分析题图及题意，质粒上含有X抗生素抗性基因（XR）和Y抗生素抗性基因（YR），其中XR内部含有限制酶KasⅠ识别序列，YR内部含有限制酶FseⅠ、HpaⅡ、NaeⅠ、NgoM Ⅳ识别序列，五种酶的识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列，限制酶NgoM Ⅳ切割DNA分子后露出的黏性末端与目的基因两端的黏性末端相同。
【详解】（1）由目的基因形成的黏性末端可知，只有NgoM IV酶切后的黏性末端为5'-GGCC，可以与目的基因形成的黏性末端互补配对，因此若要将图B所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒，则质粒需用限制酶NgoM IV切开，将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后连接，一般先用Ca2+处理大肠杆菌后，使其处于感受态，再对其进行导入操作。
（2）质粒中的X抗生素抗性基因 未破坏，Y抗生素抗性基因（YR）由于插入目的基因而破坏，因此取导入处理过的大肠杆菌接种到含有抗生素X的培养基中培养，为获得纯种，应在固体培养基上培养，因此培养基需要加入琼脂。Y抗生素抗性基因（YR）由于插入目的基因而破坏，因此取部分菌体接种到含有抗生素Y的培养基中，若无菌落生长，可初步确定获得的培养物符合要求；若有菌落生长，说明质粒重新环化或质粒间发生自身环化，使得大肠杆菌同时具备基因XR和YR。
（3）由图C可知，若要扩增出450 bp片段，且含有目的基因，只能选择引物甲和丙进行PCR。由“扩增出了400bp片段”，即引物甲右侧部分+目的基因，可能是目的基因反向连接，如下图：
17．（2023·安徽合肥·合肥一中校考模拟预测）1997 年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到 2015 年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量 40 万吨，增收节支社会经济效益 450 亿元。
(1)培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：__________、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(2)研究表明，苏云金杆菌中的 Bt 抗虫蛋白基因，是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，其控制合成的 Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的___________性环境中才能表现出毒性。Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的___________结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
(3)明确了目的基因后，获取目的基因的方法有多种，其中，利用 PCR 获取是常用的一种方法。以下关于 PCR 说法正确的是 （多选）
A．PCR 过程需提供DNA 模板
B．PCR 过程中新链的合成只能从端→端
C．PCR 过程需打开磷酸二酯键
D．可以利用 PCR 技术进行目的基因扩增
(4)在基因表达载体的构建过程中，若目的基因经限制酶切开后呈图1所示的末端，那么图2中的载体质粒pCLY15需用____________和____________切开，才能与目的基因片段高效连接。
(5)在基因工程的基础上，延伸出来了第二代基因工程——蛋白质工程。天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的基本思路与之____________（填“相同”或“相反”）。蛋白质工程是指以________________作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白，或制造一种新的蛋白，以满足人类生产和生活的需求。
17．(1)目的基因的筛选与获取
(2)碱 特异性受体
(3)ABD
(4) KpnI XmaI
(5)相反 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；④个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
（2）研究表明，苏云金杆菌中的 Bt 抗虫蛋白基因，是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，其控制合成的 Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性。Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
（3）A、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变性原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，A正确；
B、由于DNA聚合酶只能将游离的核苷酸加到新链的3’端，所以DNA新链的合成方向只能从5’端向3’端延伸，B正确；
C、PCR过程需要高温变性，解开的是氢键，而不是磷酸二酯键，C错误；
D、获得目的基因的方法之一为PCR扩增，D正确。
故选ABD。
（4）根据酶切位点分析，目的基因应位于启动子和终止子之间，为高效连接应选用黏性末端相同的酶，而不能选用平末端，故目的基因应使用KpnI和XmaI切割。
（5）天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，而蛋白质工程与之相反。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。
18．（2023·河北·河北巨鹿中学校联考三模）二十碳五烯酸（EPA）能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物中提取了EPA合成途径的关键基因，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。图1和图2分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA片段和质粒。回答下列问题：
(1)根据图1分析，利用PCR扩增基因时，所选用的引物是______。在PCR仪中进行n次循环，需要消耗______个引物。
(2)构建基因表达载体时，应选择______这两种限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是______。
(3)据图2分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了______的培养基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。
(4)采用PCR等技术可检测基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过______来鉴定，DNA分子的迁移速率与______有关。
18．(1)引物5和引物4
(2)BamHⅠ和HindⅢ 避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接
(3)氨苄青霉素
(4)琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。
【详解】（1）利用PCR扩增目的基因时，子链的延伸方向是5′端→3′端，扩增产物应该包含酶切位点序列，所以选用的引物为引物5和引物4。一个DNA分子经过n次复制形成2n个DNA，共含有2n+1条链，除两条亲代的模板链外，剩下的每一条链的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2n+1−2个引物。
（2）结合图1上DNA片段上限制酶的切割位置可知，使用SmaⅠ会破坏目的基因，使用EcoRⅠ会导致目的基因两侧产生相同的黏性末端，不利于目的基因和质粒的高效连接，因此应选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别切割含目的基因的DNA和质粒。采用双酶切的方法对含目的基因的DNA和质粒进行切割，可以避免目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因与质粒的反向连接。
（3）由图2可知，四环素抗性基因会被限制酶破坏，因此筛选目的基因成功导入并表达的酵母菌时，可用添加氨苄青霉素的培养基培养酵母菌。
（4）采用PCR等技术检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中时，得到的PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
19．（2023·广东汕头·金山中学校考三模）酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。科研人员为了研究R基因对酵母菌絮凝性能的影响，用基因工程技术获得了R基因敲除的酵母菌菌株，主要步骤如图1。（注：G基因为抗生素G418抗性基因）。请据图1回答下列问题：
(1)过程①采用_________技术获取R基因左右两端的N片段和C片段，该技术在目的基因的检测与鉴定这一步骤中用于检测________________（写出一点即可）。
(2)过程②所需的工具酶有__________。过程③将构建的重组质粒线性化后转化进酵母菌，再利用含________的培养基筛选出重组酵母菌，最后挑取单菌落进一步筛选出R基因被敲除的酵母菌。
(3)科研人员继续将野生型酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，一定条件下静置发酵7天，测定酒精发酵能力和絮凝能力，结果如下表。
指标
种类
酒精发酵能力
絮凝能力
野生型酵母菌
4.5％
63％
R基因敲除酵母菌
4.5％
83％
据实验结果分析，R基因敲除酵母菌是否更符合生产需求？______________（填“是”或“否”），判断依据是______________________。
(4)为了进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制，将R基因敲除酵母菌和野生型酵母菌分别用无菌水进行梯度稀释，再将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30ug/mL刚果红（细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装，抑制酵母菌生长）的完全培养基上，培养适当时间后观察到的菌落生长情况如图2、图3。
综合上述实验结果，推测R基因敲除酵母菌絮凝能力变化的原因可能是______。
(5)若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：______。
19．(1) PCR 目的基因是否导入受体细胞或目的基因是否转录出mRNA
(2) BamHⅠ、HindⅢ、DNA连接酶 抗生素G418
(3)是 R基因敲除后酵母菌的发酵能力不变，而絮凝能力增强
(4)R基因缺失增强了酵母菌对细胞壁抑制剂的耐性或R基因缺失减弱细胞壁抑制剂的危害或R基因敲除使菌株细胞壁组装能力提高
(5)R基因敲除菌株的食用安全性或R基因敲除菌株的遗传稳定性等
【分析】对目的基因分子水平上的检测通过PCR等技术检测受体细胞中是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从受体细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译出相关蛋白等。
【详解】（1）过程①是对N和C片段的PCR扩增，PCR技术还可以用于检测目的基因是否导入受体细胞或目的基因是否转录出mRNA。
（2）过程②要对质粒进行切割，以及N片段、C片段与质粒的重组，因此用到的工具酶为限制酶BamH Ⅰ、HindⅢ，还需要DNA连接酶，过程③将构建的重组质粒线性化后转化进酵母菌，重组质粒上含有G基因，G基因为抗生素G418抗性基因，因此可以利用含抗生素G418的培养基筛选出重组酵母，最后挑取单菌落进一步筛选出R基因被敲除的酵母菌。
（3）由题干信息可知，酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。据图分析，野生型酵母菌和R基因敲除酵母菌的酒精发酵能力相同，但R基因敲除酵母菌的絮凝能力高于野生型酵母菌，因此R基因敲除酵母菌更符合生产需求。
（4）由图3可知，R基因敲除酵母菌比野生型酵母菌对刚果红的抵抗能力更强，刚果红为细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装，抑制酵母菌生长，说明R基因敲除酵母菌可以抵抗细胞壁的破坏，即R基因缺失增强了酵母菌对细胞壁抑制剂的耐性或R基因缺失减弱细胞壁抑制剂的危害或R基因敲除使菌株细胞壁组装能力提高。
（5）若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒需要考虑R基因敲除菌株的食用安全性或R基因敲除菌株的遗传稳定性等问题。
20．（2023·湖北武汉·校联考模拟预测）胶原蛋白是一种生物性高分子物质，应用领域包括生医材料、化妆品、食品工业、研究用途等。随着科技的不断进步，可运用基因工程技术等进行胶原蛋白的生产重组，在先进技术驱动下，重组胶原蛋白生产量有所提升。回答下列问题：
(1)胶原蛋白由多个原胶原构成，由胶原蛋白基因控制合成。人胶原蛋白基因主要是从cDNA文库中获取，简要概述cDNA文库的构建过程：_____________。
(2)从理论上看，可利用转基因鼠来获得大量重组胶原蛋白。科学家已将αS1-乳腺酪蛋白基因片段及胶原蛋白基因片段进行基因工程重组，获得重组DNA分子。后续的操作是_____________，再将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物，转基因的雌鼠进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来获得所需的重组胶原蛋白。
(3)当前基因工程技术生产重组胶原蛋白，存在动植物细胞成本高、难度高的限制，无法实现规模化胶原蛋白生产，故从产业发展角度来看，宿主细胞选择微生物较为合适。微生物作为基因工程宿主细胞的优点有_____________（写两项）。利用大肠杆菌作宿主细胞，首先要用Ca处理，这一处理是否完成了转化? ____________，原因是____________。
(4)目前，通过基因工程获得的胶原蛋白与天然胶原蛋白相比，羟脯氨酸含量低。为此，可以通过蛋白质工程对____________进行改造，生产出与天然胶原蛋白一样的胶原蛋白，满足人们的生产和生活需求。
20．(1)提取细胞mRNA反转录（或逆转录）成多种cDNA，与载体连接后储存在受体菌群中
(2)将重组DNA分子导入受精卵
(3)结构简单、繁殖速度快、遗传物质少等 否（或没有） 转化指的目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，Ca2+处理使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子状态的感受态细胞，目的基因未进入受体细胞
(4)（胶原蛋白）基因
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
【详解】（1）cDNA文库的构建过程：提取细胞的mRNA，在逆转录酶的作用下以mRNA为模板，反转录（或逆转录）成多种cDNA，与载体连接后储存在受体菌群中。
（2）基因工程中动物受体细胞一般选择受精卵。获得重组DNA分子，将重组DNA分子导入受精卵，再将受精卵送入母体内，可获得转基因动物。
（3）微生物作为基因工程宿主细胞的优点有多为单细胞，结构简单，繁殖速度快，遗传物质少等。转化指的目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。Ca2+处理使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子状态的感受态细胞，目的基因未进入受体细胞。Ca2+处理并没有完成转化。
（4）蛋白质工程是对控制蛋白质合成的基因进行改造，从而实现对相应蛋白质的改变。通过基因工程获得的胶原蛋白与天然胶原蛋白相比，羟脯氨酸含量低。为此，可以通过蛋白质工程对（胶原蛋白）基因进行改造。
专题18 基因工程
一、单选题
1．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
1．B
【分析】分析题图：AT1蛋白通过抑制PIP2s蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。AT1蛋白缺陷，可以提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；
B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；
C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。
故选B。
2．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2．B
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；
B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；
D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。
故选B。
3．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
3．C
【分析】1、DNA分子复制的过程：
①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。
②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。
③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构。从而形成2个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子。
2、限制酶和DNA聚合酶作用的对象都是磷酸二酯键。
【详解】A、由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；
B、填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B正确；
C、DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；
D、癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。
故选C。
4．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
4．D
【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
故选D。
5．（2023·广东·统考高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
5．D
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。
3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；
B、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；
C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；
D、将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
故选D。
6．（2023·广东·统考高考真题）中外科学家经多年合作研究，发现circDNMT1（一种RNA分子）通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，为解决乳腺癌这一威胁全球女性健康的重大问题提供了新思路。下列叙述错误的是（ ）
A．p53基因突变可能引起细胞癌变
B．p53蛋白能够调控细胞的生长和增殖
C．circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变慢
D．circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究
6．C
【分析】人和动物细胞中的DNA上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、p53基因是抑癌基因，这类基因突变可能引起细胞癌变，A正确；
B、p53基因是抑癌基因，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或促进细胞凋亡，B正确；
C、依据题意，circDNMT1通过与抑癌基因p53表达的蛋白结合诱发乳腺癌，则circDNMT1高表达会使乳腺癌细胞增殖变快，C错误；
D、circDNMT1的基因编辑可用于乳腺癌的基础研究，D正确。
故选C。
7．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
7．C
【分析】DNA连接酶：
（1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。
（2）DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；
D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
故选C。
二、综合题
8．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
8．(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
9．（2023·湖南·统考高考真题）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是_________。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是________。
(2)此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为 ）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为_________（写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为________bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为_____mg.d-1。
9．(1)常染色体隐性遗传病 1/32
(2) 5'-TAAGGT-3' 8和302
(3)4
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中。随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合
【详解】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1与I-2均表现正常，他们关于甲病的基因型均为+/-，而他们的女儿Ⅱ-4患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病，由I-1、I-2和Ⅱ-3关于乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以I-1和I-2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
（2）本题研究甲基因突变情况，二代1为杂合子，兼有正常甲基因和突变甲基因。目的基因为甲基因，扩增引物应为两基因共有的TAAGGT。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段为8和2+293+7=302bp,突变甲基因无法被酶切，故不写。后续可通过电泳等手段区分开，达到检测甲基因突变情况的目的。
（3）Ⅲ-2关于乙的基因型为-/-，有患NTDs的可能，因此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为4mg·d-1。
10．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。
10．(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3)将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
11．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞）_______（填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对_______和_______生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_________。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_________。
11．(1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
12．（2023·北京·统考高考真题）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
(1)我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是___________。
(2)科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→___________→电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为___________条。
(3)油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大规模种植成为可能。品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，由此可大量繁殖A。在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来提高种子S的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1生产种子S的育种流程见图丙。
①图丙中，A植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1杂交，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为_______________。
②为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，简单易行的田间操作用____________________________。
12．(1)黄化叶
(2)用限制酶B处理 3
(3) 50% 在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。
【详解】（1）野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，由此可以推测黄化叶是隐性性状。
（2）检测F2基因型的实验步骤为：：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→用限制酶B处理→电泳。野生型基因电泳结果有一条带，叶黄化的基因电泳结果有两条带，则F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
（3）①油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），设育性基因为A、a，叶色基因为B、b，可判断雄性不育品系A为显性纯合子（AA），R为隐性纯合子（aa），A植株的绿叶雄性不育子代（AaBb）与黄化A1（aabb）杂交，后代中一半黄化，一半绿叶，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为50%。
②A不纯会影响种子S的纯度，为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，应在开花前把田间出现的绿叶植株除去。
13．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。
13．(1)负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2)基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
14．（2023·全国·统考高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。
14．(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握：
①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。
②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。
③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
15．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_____。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_____。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取_____进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_____。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_____
15．(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2)筛选 RNA聚合酶
(3)核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【分析】基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
16．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
16．(1)再生 叶
(2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用
(3)同一个杂种融合原生质体 ABD
(4)再分化 根和芽
(5)模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【分析】1、植物组织培养过程：离体的植物组织经过脱分化形成愈伤组织，经过再分化愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
2、植物体细胞杂交可以克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离，操作过程包括:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞筛选、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定等步骤。
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
17．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
17．(1)野生型
(2)运载体 启动子和终止子
(3)DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
一、单选题
1．（2023·河南新乡·校考模拟预测）下列关于生物学实验的叙述中，不正确的是（ ）
A．在“观察洋葱根尖有丝分裂”和“观察细胞中RNA和DNA分布”的实验中加入盐酸的目的有所不同
B．在色素的提取和分离实验中，叶绿素b在层析液中的溶解度最低，扩散速度最慢
C．双缩脲试剂和斐林试剂的化学成分相同，只是个别物质的浓度不同
D．制取细胞膜和提取DNA都可以用鸡血作为实验材料
1．D
【分析】1、在“观察洋葱根尖有丝分裂”的实验中加入质量分数为15%的HCl溶液和95%的酒精溶液按1：1体积比的比例混合成解离液；“观察细胞中DNA和RNA分布”的实验中加入盐酸的质量浓度为8%和目的为能够改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，同时使染色质中的DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合；
2、斐林试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05 g/mL的硫酸铜溶液，要现配现用，斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化为：砖红色（沉淀）；双缩脲试剂的成分是质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.01 g/mL的硫酸铜溶液，双缩脲试剂鉴定蛋白质时，要先用双缩脲试剂A试剂与蛋白质混合后，再用B试剂，才可产生紫色反应。
【详解】A、在“观察洋葱根尖有丝分裂”实验中盐酸的作用是解离，“观察细胞中DNA和RNA分布”的实验中盐酸的作用是改变细胞膜通透性和使DNA与蛋白质分离开，A正确；
B、在色素的提取和分离实验中，胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，叶绿素b的溶解度最低，B正确；
C、据分析可知，双缩脲试剂和斐林试剂的化学成分相同，主要是NaOH和CuSO4，用法不同，它们物质的浓度也不同，C正确；
D、制备细胞膜不能用鸡血作材料，因为有其他膜的干扰，制备细胞膜时用哺乳动物的红细胞在材料，D错误。
故选D。
2．（2023·广东汕头·金山中学校考三模）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（ ）
A．分子运输车-载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等
B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸互补链
C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞
D．含目的基因的植物受体细胞可能无需培养成完整植株
2．D
【分析】基因工程技术的基本步骤是：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：
①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；
②检测目的基因是否转录出了mRNA；
③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，A正确；
B、若利用PCR技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶延伸子链，B错误；
C、接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，C错误；
D、为了大量生产人血清白蛋白，可从愈伤组织获得，无需培养为完整植株，D正确。
故选D。
3．（2023·河北·统考模拟预测）基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接形成基因表达载体。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理（如表所示），其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因载体经酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是（ ）
分组
相应酶切处理
甲
限制酶H1
乙
限制酶H2
丙
限制酶H1+H2
A．该基因载体最有可能为环状DNA分子
B．限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点
C．限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0.2kb
D．限制酶作用于该载体时会直接导致氢键和磷酸二酯键的断裂
3．D
【分析】基因工程中，在构建基因表达载体时，需使用同种限制酶切割目的基因与载体，使其形成相同末端以便使用DNA连接酶进行连接。可通过标记基因的作用来检测受体细胞是否含有目的基因。
【详解】A、由图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；
B、当用一种限制酶切割载体时，产生的DNA片段等长，而用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在该载体上都有酶切位点，B正确；
C、用两种限制酶同时切割载体时，产生0.6kb和0.2kb两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距0.2kb，C正确；
D、限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
故选D。
4．（2023·广东梅州·统考三模）以菜花为材料提取DNA时，需将材料进行研磨，研磨液的成分常含有SDS(蛋白质变性剂)、EDTA(DNA酶抑制剂，稳定DNA活性)、Tris(缓冲剂)。下列有关叙述错误的是（ ）
A．若选择鸡血细胞为材料，则省去了研磨过程
B．SDS可以使蛋白质变性，便于DNA与蛋白质分离
C．EDTA可以防止DNA水解成核糖核苷酸
D．Tris可以调节溶液中的pH
4．C
【分析】提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
【详解】A、鸡血细胞悬浮液作为实验材料，利用细胞吸水涨破的原理，省去了研磨过程，A正确；
B、SDS是蛋白质变性剂，可使蛋白质结构变得松散，使染色体中DNA和蛋白质分离，B正确；
C、DNA的基本单位是脱氧核苷酸，EDTA是DNA酶抑制剂，可以防止DNA水解成脱氧核苷酸，C错误；
D、Tris是缓冲剂，可调节溶液中的pH，D正确。
故选C。
5．（2023·山东·山东师范大学附中校考模拟预测）下列关于基因工程及其应用的叙述，错误的是（ ）
A．花粉管通道法可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
B．只要从转基因棉花中检测到Bt抗虫蛋白，就代表转基因抗虫棉培育成功
C．Bt抗虫蛋白被分解为多肽后与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔
D．干扰素是一种糖蛋白，科学家用基因工程方法从大肠杆菌细胞内获得了干扰素
5．B
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①通过PCR技术检测目的基因是否插入待测生物体内以及是否转录出相应的RNA；②利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质；③个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、我国科学家用独创的花粉管通道法将Bt基因导入棉花细胞，如可以用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中，A正确；
B、从转基因棉花中检测到Bt抗虫蛋白，还需要进行个体生物学鉴定才能说明转基因抗虫棉是否培育成功，B错误；
C、Bt抗虫蛋白被分解成多肽后，多肽与某类昆虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，因而能破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，C正确；
D、干扰素是一种糖蛋白，科学家利用大肠杆菌代谢旺盛的特点，用基因工程方法从大肠杆菌细胞内获得了干扰素，D正确。
故选B。
6．（2023·北京·北大附中校考模拟预测）研究者对绿色荧光蛋白进行改造，将其第203位苏氨酸替换为酪氨酸，使改造后的蛋白质在特定光激发后发射橙色光，称为橙色荧光蛋白。关于橙色荧光蛋白的构建，以下说法正确的是（ ）
A．用蛋白酶直接处理绿色荧光蛋白获得目标产物
B．设计定点突变PCR获得橙色荧光蛋白基因
C．PCR扩增获得的产物激发后可以发橙色荧光
D．绿色荧光蛋白基因发生的突变类型为碱基缺失
6．B
【分析】基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变。蛋白酶催化蛋白质中肽键的水解，使蛋白质分解成小分子氨基酸。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过改造基因或合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，这种技术最终只能通过操作基因来完成。
【详解】A、用蛋白酶直接处理绿色荧光蛋白得到的是各种氨基酸，而不是第203位苏氨酸替换为酪氨酸的橙色荧光蛋白，A错误；
B、要使绿色荧光蛋白第203位苏氨酸替换为酪氨酸，可以通过对其基因进行定点突变PCR实现，这样基因中控制苏氨酸的碱基序列替换为合成酪氨酸的碱基序列，B正确；
C、PCR扩增获得的产物是目的基因片段，不能发橙色荧光，只有该基因片段控制合成的蛋白质才会在激发后发橙色荧光，C错误；
D、绿色荧光蛋白基因发生的突变类型为碱基替换，D错误。
故选B。
7．（2023·广东·广州市第二中学校联考模拟预测）蛋白质的空间结构是生命科学研究领域的热点内容。某科研团队利用人工智能AI开发的AlphaFold2程序对大部分蛋白质结构的预测极为精准。下列叙述错误的是（ ）
A．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
B．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础
C．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程
D．结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制
7．A
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
【详解】A、由于一种氨基酸可能有多种密码子，因此新蛋白质的氨基酸序列推出的基因序列不止一种，A错误；
B、氨基酸脱水缩合形成多肽，多肽盘曲折叠形成具有一定空间结构的蛋白质。因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，B正确；
C、蛋白质工程能通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，C正确；
D、人工智能程序AlphaFold2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，因此结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，D正确。
故选A。
8．（2023·山东菏泽·山东省鄄城县第一中学校考三模）CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体（如图）．利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B．sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C．基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D．通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
8．D
【分析】CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。
【详解】AB、Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑，AB正确；
C、复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，C正确；
D、通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。
故选D。
9．（2023·海南海口·海南华侨中学校考一模）环境DNA（eDNA）是“在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合”，它涵盖的范围非常广泛，无论是土壤、空气、液体，甚至是排泄物，都可以从中找到可作为样品的eDNA。下列有关说法正确的是（ ）
A．A-T和G-C两种碱基对排列在eDNA的内侧构成基本骨架
B．脱氧核糖和磷酸的排列顺序决定了eDNA结构具有多样性和特异性
C．PCR扩增微量的样品eDNA利用的原理是DNA半保留复制
D．eDNA获取的生物信息不可用于动物种群的监测、管理和保护
9．C
【分析】DNA分子结构的主要特点：DNA是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的双螺旋结构；DNA的外侧由脱氧核糖和磷酸交替连接构成的基本骨架，内侧是碱基通过氢键连接形成的碱基对，碱基之间的配对遵循碱基互补配对原则（A-T、C-G）。
【详解】A、脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成DNA的基本骨架，A错误；
B、碱基对排列顺序的千变万化，构成了DNA分子的多样性，碱基对的特定排列顺序，又构成了每一个DNA分子的特异性，B错误；
C、PCR是一项体外扩增DNA的技术，故扩增微量的样品eDNA利用的原理是DNA半保留复制，C正确；
D、环境DNA（eDNA）技术是一种新型生物资源调查手段，是指从环境中提取DNA片段，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等，故eDNA获取的生物信息可用于动物种群的监测、管理和保护，D错误。
故选C。
10．（2023·湖南娄底·校联考模拟预测）基因通常是具有遗传效应的DNA片段。下列关于真核生物基因的描述，不正确的是（ ）
A．真核生物的胰岛素基因在一定条件下可以在细菌细胞中表达
B．基因表达的最终产物大都是承担细胞相应生命活动的蛋白质
C．刚转录完成的RNA序列与结合到核糖体上的该基因的mRNA序列不同
D．某组织细胞中全部的mRNA 逆转录出的DNA包含该生物所有的基因
10．D
【分析】1、DNA的结构：①由两条、反向平行的脱氧核苷酸链盘旋成双螺旋结构。②外侧：脱氧核糖和磷酸交替连接构成基本骨架。内侧：由氢键相连的碱基对组成。③碱基配对有一定规律：A=T，G≡C。（碱基互补配对原则）。
2、基因的概念：基因是具有遗传效应的DNA片段，是决定生物性状的基本单位。
3、基因和染色体的关系：基因在染色体上，并且在染色体上呈线性排列，染色体是基因的主要载体。
【详解】A、由中心法则可知，所有生物共用一套遗传密码，真核生物的基因在一定条件下是可以在原核细胞中表达的，如转入人胰岛素基因的细菌，A 正确；
B、基因表达的最终产物大都是蛋白质并承担细胞相应功能，也有一些基因表达产物就是RNA 并直接参与生命活动，如RNA类酶、tRNA 等，B正确；
C、真核基因刚转录完成的mRNA 需要剪切加工，成为成熟mRNA 后结合到核糖体上开始翻译，C正确；
D、某组织细胞中全部的mRNA是由该细胞在分化过程中，部分基因表达产生的，由该细胞的全部的mRNA逆转录出的DNA仅包含该细胞已表达的基因，只是该生物所含基因的一部分，D错误。
故选D。
二、多选题
11．（2023·山东烟台·统考模拟预测）红细胞生成素（EPO）是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列有关叙述正确的是（ ）
A．构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的下游
B．一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达
C．用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中可合成并提取EPO
D．用PCR扩增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
11．ABD
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心，包括启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点等，启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA最终表达出人类需要的蛋白质。
【详解】A、启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，故构建表达载体时需将EPO基因（目的基因）插入乳腺蛋白基因的启动子的下游，A正确；
B、某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO，所以一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达，B正确；
C、用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的受精卵（将来发育成雌性个体）中，待其发育到一定阶段，方可合成EPO，C错误；
D、用PCR扩增人EPO基因，前提是需要一段已知的EPO基因核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，D正确。
故选ABD。
12．（2023·江苏扬州·统考三模）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD) 替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG) ，可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A．转入的 L -PG 基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B．L-PG 基因替换质粒上的 PD 基因是通过同源重组实现的
C．标记基因A m pr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D．可以利用 PCR 技术筛选含有 L-PG 基因的受体细胞
12．ABD
【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。
【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；
B、由图可知，通过基因工程技术实现酵母菌的PD基因被替换为L-PG基因，基因工程的实质是基因重组，B正确；
C、标记基因Amp可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；
D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
故选ABD。
13．（2023·江西·江西省宜春市第一中学校联考模拟预测）冠状病毒家族S蛋白胞内半胱氨酸富集区（CRD）是S蛋白介导膜融合和病毒感染所必需的保守功能域，为探究CRD是否可作为新型药物干预靶点，研究人员根据对蛋白质功能的特定需求，采取与S蛋白竞争性抑制思路，最终设计合成了一种穿膜多肽 S-CRD（由三种短肽融合组成），S-CRD 对不同突变型的新冠病毒作用效果如图所示。下列说法正确的是（ ）
A．不同突变型新冠病毒的遗传物质彻底水解产物相同
B．S-CRD的制备可以通过改造或合成基因来实现
C．CRD结构域可能成为研发广谱抗冠状病毒药物的新型干预靶点
D．S-CRD通过直接抑制RNA复制来抑制病毒增殖，且抑制效果与浓度有关
13．ABC
【分析】蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。
【详解】A、不同突变型新冠病毒的遗传物质都是RNA，彻底水解的产物是相同的，A正确；
B、设计合成一种穿膜多肽S-CRD属于蛋白质工程，需要通过改造或合成基因来实现，B正确；
C、从图中看出加入CRD后，变异株的RNA复制量降低，说明该物质可以抑制病毒的增殖，且随着浓度的增加，抑制作用增强，所以可能成为研发广谱抗冠状病毒药物的新型干预靶点，C正确；
D、根据题干信息“冠状病毒家族S蛋白胞内半胱氨酸富集区（CRD）是S蛋白介导膜融合和病毒感染所必需的保守功能域，而采取与S蛋白竞争性抑制思路，最终设计合成了一种穿膜多肽S-CRD”，说明CRD是和S蛋白竞争相应的位点，而不是直接抑制RNA复制来抑制病毒增殖，D错误。
故选ABC。
三、综合题
14．（2023·江苏盐城·盐城中学校考模拟预测）党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯是我国重要的粮食作物之一。致病疫霉导致的晚疫病及干旱、高低温和盐胁迫等是导致马铃薯减产的重要原因。研究人员为探究StNPR4和tproNPR4基因在马铃薯应对致病疫霉和高盐胁迫中的功能进行了相关实验，基因表达载体构建示意图如下。
(1)用SacⅡ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR－L16质粒用___________酶连接，构建重组pENTR－L16。
(2)经____________酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
(3)将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是____________法，它利用了T－DNA的____________特性，最终使目的基因整合到马铃薯细胞____________上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。下图A表示马铃薯基因相对表达量分析，B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150mmol·L-1的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，**表示组别间差异达到极显著水平。
①据图A分析，只有转基因品系____________的表达量显著低于野生型（WT）和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
②据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的优势是具有_____________，致病疫霉相对生物量低：生根率高，____________。
(4)为研究转基因马铃薯植株的分子机理，研究人员利用Taqman探针和反转录PCR技术，对转基因马铃薯StproNPR4和StNPR4基因的表达进行检测：
①StproNPR4基因的两端碱基序列如下：
采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5'－CTTGGATGAT－3'，则引物1的序列为____________（标出5'和3’端，写出前6个碱基即可）。
②Tagman探针的结构如图所示，由于探针有_____________的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。在PCR过程中，Taq酶体现出_____________酶活性，在相同扩增时间中，总荧光值与待测基因的_____________成正比。
③经检测，转基因马铃薯水杨酸（SA）信号通路相关蛋白基因表达量显著上升，SA是一种植物抗病有关的调节物质。研究人员推测L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，欲验证这一假设，需要进行的实验是____________。
14．(1)DNA连接
(2)SacⅡ和Kpn1
(3)农杆菌转化 可转移 染色体的DNA 5 抗病性 存活能力强
(4) 5'－TCTGTT－3' 碱基互补配对 DNA聚合 mRNA（转录）量 敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）用SacⅡ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR－L16质粒具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接，构建重组pENTR－L16。
（2）分析题图可知，两个质粒都有SacⅡ和Kpn1的酶切位点，故经SacⅡ和Kpn1酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
（3）将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是农杆菌转化法，T－DNA是可转移DNA，能够最终使目的基因整合到马铃薯细胞染色体的DNA上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。
①A表示马铃薯基因相对表达量分析，据图A分析，只有转基因品系5的表达量显著低于野生型（WT）和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
②B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150mmol·L·的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，图中的**表示组别间差异达到极显著水平。据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的致病疫霉相对生物量低，说明具有抗病性；而生根率高，故干旱条件下存活能力强。
（4）引物需要与模板链的3'端互补配对，即-OH端，故根据StproNPR4基因两端碱基序列可知，采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5'－CTTGGATGAT－3'，则引物1的序列为5'－TCTGTT－3'。
②依据Tagman探针的结构图可知，由于探针有碱基互补配对的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。在PCR过程中，Taq酶体现出DNA聚合酶活性，然后，在延伸过程中，DNA 聚合酶启动聚合并对引物执行 5' → 3' 核酸外切酶活性。DNA 聚合酶将荧光素和猝灭剂分开。然后，游离荧光素发出荧光。 故在相同扩增时间中，总荧光值与待测基因的mRNA（转录）量成正比。
③分析题意，实验目的为验证L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，自变量为有无SA途径，故欲验证这一假设，需要进行的实验是敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况。
15．（2023·广东·广州市第二中学校联考模拟预测）人血清白蛋白（HISA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母困基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是四种不同的限制酶，具各目识别的酶切位点如表所示。请回答：
限制酶
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
识别序列及切割位点
(1)工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、______、接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，其中，______是该工程的中心环节。
(2)利用PCR技术扩增HSA基因需要引物，设计引物的原则是______。（答出两点即可）
(3)科研人员将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶______进行共同切割，原因是______（答出2点即可）。
(4)构建的基因表达载体中需要使用酵母菌蛋白基因的启动子AOX，原因是______。将受体酵母菌置于含有____的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
15．(1)培养基的配制、灭菌 发酵
(2)与模板链碱基互补配对，引物之间或引物内部不能互补配对，引物长度通常为20-30个核苷酸
(3) Ⅱ、Ⅳ 质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点；使用限制酶Ⅰ会使质粒的启动子丢失或标记基因被破坏；使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接
(4) AOX有利于HAS基因在酵母菌细胞内的表达 四环素
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）发酵工程的内容包括菌种选育、扩大培养、培养基的配制、灭菌、接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。发酵工程的中心环节是发酵过程。
（2）PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物之间或引物内部不能互补配对，用于PCR的引物长度通常为20〜30个核苷酸；引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）图中四环素抗性基因中含有酶切位点Ⅰ，氨苄青霉素抗性基因中含有I、Ⅱ、Ⅳ三种酶切位点，质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点；使用限制酶Ⅰ会使质粒的启动子丢失或标记基因被破坏；使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接，因此将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶Ⅱ、Ⅳ进行共同切割。
（4）启动子是RNA聚合酶识别、结合的位点，是启动转录的位点，在构建基因表达载体时添加酵母菌蛋白基因的启动子AOX，有利于目的基因（HSA基因）在酵母菌细胞内表达。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶Ⅱ、Ⅳ进行共同切割，氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因未被破坏，故筛选时可将受体酵母菌置于含有四环素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
16．（2023·河北沧州·校考模拟预测）如图A所示，质粒上含有X抗生素抗性基因（）和Y抗生素抗性基因（），其中内部含有限制酶KasI的识别序列，内部含有限制酶Fse I、Hpa II、Nae I、NgoM IV的识别序列，五种酶的识别序列如表格所示（表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。
(1)若要将图B所示的目的基因直接插入到内形成重组质粒，则质粒需用限制酶___________切开。将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后连接，一般先用___________处理大肠杆菌后，再对其进行导入操作。
名称
说别序列及切期位点
名称
识别序列及规割位点
Fse I
Hpa II
KasI
Nae I
NgoM IV
(2)取导入处理过的大肠杆菌接种到含有抗生素___________（填“X”或“Y”）的培养基中培养，培养基___________（填“需要”或“不需要”）加入琼脂。从获得的纯培养物中取部分菌体接种到含有抗生素___________（填“X”或“Y”）的培养基中，若无菌落生长，可初步确定获得的培养物符合要求；若有菌落生长，原因是___________。
(3)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插人目的基因的重组质粒（图C所示），拟设计引物进行PCR鉴定。图C所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，若选择引物___________进行PCR，且扩增出了450 bp片段，则说明实验成功；若选择引物甲、乙进行PCR，且扩增出了400bp片段，原因是___________。
16．(1) NgoM IV
(2) X 需要 Y 质粒重新环化或质粒间发生自身环化，使得大肠杆菌同时具备基因XR和YR
(3)甲和丙 目的基因反向连接
【分析】分析题图及题意，质粒上含有X抗生素抗性基因（XR）和Y抗生素抗性基因（YR），其中XR内部含有限制酶KasⅠ识别序列，YR内部含有限制酶FseⅠ、HpaⅡ、NaeⅠ、NgoM Ⅳ识别序列，五种酶的识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列，限制酶NgoM Ⅳ切割DNA分子后露出的黏性末端与目的基因两端的黏性末端相同。
【详解】（1）由目的基因形成的黏性末端可知，只有NgoM IV酶切后的黏性末端为5'-GGCC，可以与目的基因形成的黏性末端互补配对，因此若要将图B所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒，则质粒需用限制酶NgoM IV切开，将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后连接，一般先用Ca2+处理大肠杆菌后，使其处于感受态，再对其进行导入操作。
（2）质粒中的X抗生素抗性基因 未破坏，Y抗生素抗性基因（YR）由于插入目的基因而破坏，因此取导入处理过的大肠杆菌接种到含有抗生素X的培养基中培养，为获得纯种，应在固体培养基上培养，因此培养基需要加入琼脂。Y抗生素抗性基因（YR）由于插入目的基因而破坏，因此取部分菌体接种到含有抗生素Y的培养基中，若无菌落生长，可初步确定获得的培养物符合要求；若有菌落生长，说明质粒重新环化或质粒间发生自身环化，使得大肠杆菌同时具备基因XR和YR。
（3）由图C可知，若要扩增出450 bp片段，且含有目的基因，只能选择引物甲和丙进行PCR。由“扩增出了400bp片段”，即引物甲右侧部分+目的基因，可能是目的基因反向连接，如下图：
17．（2023·安徽合肥·合肥一中校考模拟预测）1997 年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到 2015 年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100 多个，减少农药用量 40 万吨，增收节支社会经济效益 450 亿元。
(1)培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：__________、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(2)研究表明，苏云金杆菌中的 Bt 抗虫蛋白基因，是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，其控制合成的 Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的___________性环境中才能表现出毒性。Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的___________结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
(3)明确了目的基因后，获取目的基因的方法有多种，其中，利用 PCR 获取是常用的一种方法。以下关于 PCR 说法正确的是 （多选）
A．PCR 过程需提供DNA 模板
B．PCR 过程中新链的合成只能从端→端
C．PCR 过程需打开磷酸二酯键
D．可以利用 PCR 技术进行目的基因扩增
(4)在基因表达载体的构建过程中，若目的基因经限制酶切开后呈图1所示的末端，那么图2中的载体质粒pCLY15需用____________和____________切开，才能与目的基因片段高效连接。
(5)在基因工程的基础上，延伸出来了第二代基因工程——蛋白质工程。天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的基本思路与之____________（填“相同”或“相反”）。蛋白质工程是指以________________作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白，或制造一种新的蛋白，以满足人类生产和生活的需求。
17．(1)目的基因的筛选与获取
(2)碱 特异性受体
(3)ABD
(4) KpnI XmaI
(5)相反 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；④个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
（2）研究表明，苏云金杆菌中的 Bt 抗虫蛋白基因，是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，其控制合成的 Bt 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性。Bt 抗虫蛋白被分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
（3）A、PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制的过程，利用DNA分子热变性原理，通过控制温度控制控制DNA分子的解聚和结合，A正确；
B、由于DNA聚合酶只能将游离的核苷酸加到新链的3’端，所以DNA新链的合成方向只能从5’端向3’端延伸，B正确；
C、PCR过程需要高温变性，解开的是氢键，而不是磷酸二酯键，C错误；
D、获得目的基因的方法之一为PCR扩增，D正确。
故选ABD。
（4）根据酶切位点分析，目的基因应位于启动子和终止子之间，为高效连接应选用黏性末端相同的酶，而不能选用平末端，故目的基因应使用KpnI和XmaI切割。
（5）天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，而蛋白质工程与之相反。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。
18．（2023·河北·河北巨鹿中学校联考三模）二十碳五烯酸（EPA）能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物中提取了EPA合成途径的关键基因，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。图1和图2分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA片段和质粒。回答下列问题：
(1)根据图1分析，利用PCR扩增基因时，所选用的引物是______。在PCR仪中进行n次循环，需要消耗______个引物。
(2)构建基因表达载体时，应选择______这两种限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是______。
(3)据图2分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了______的培养基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。
(4)采用PCR等技术可检测基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过______来鉴定，DNA分子的迁移速率与______有关。
18．(1)引物5和引物4
(2)BamHⅠ和HindⅢ 避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接
(3)氨苄青霉素
(4)琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
【分析】PCR原理:在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。
【详解】（1）利用PCR扩增目的基因时，子链的延伸方向是5′端→3′端，扩增产物应该包含酶切位点序列，所以选用的引物为引物5和引物4。一个DNA分子经过n次复制形成2n个DNA，共含有2n+1条链，除两条亲代的模板链外，剩下的每一条链的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2n+1−2个引物。
（2）结合图1上DNA片段上限制酶的切割位置可知，使用SmaⅠ会破坏目的基因，使用EcoRⅠ会导致目的基因两侧产生相同的黏性末端，不利于目的基因和质粒的高效连接，因此应选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别切割含目的基因的DNA和质粒。采用双酶切的方法对含目的基因的DNA和质粒进行切割，可以避免目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因与质粒的反向连接。
（3）由图2可知，四环素抗性基因会被限制酶破坏，因此筛选目的基因成功导入并表达的酵母菌时，可用添加氨苄青霉素的培养基培养酵母菌。
（4）采用PCR等技术检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中时，得到的PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
19．（2023·广东汕头·金山中学校考三模）酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。科研人员为了研究R基因对酵母菌絮凝性能的影响，用基因工程技术获得了R基因敲除的酵母菌菌株，主要步骤如图1。（注：G基因为抗生素G418抗性基因）。请据图1回答下列问题：
(1)过程①采用_________技术获取R基因左右两端的N片段和C片段，该技术在目的基因的检测与鉴定这一步骤中用于检测________________（写出一点即可）。
(2)过程②所需的工具酶有__________。过程③将构建的重组质粒线性化后转化进酵母菌，再利用含________的培养基筛选出重组酵母菌，最后挑取单菌落进一步筛选出R基因被敲除的酵母菌。
(3)科研人员继续将野生型酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接种到装有麦芽汁的锥形瓶中，一定条件下静置发酵7天，测定酒精发酵能力和絮凝能力，结果如下表。
指标
种类
酒精发酵能力
絮凝能力
野生型酵母菌
4.5％
63％
R基因敲除酵母菌
4.5％
83％
据实验结果分析，R基因敲除酵母菌是否更符合生产需求？______________（填“是”或“否”），判断依据是______________________。
(4)为了进一步研究R基因影响絮凝能力的作用机制，将R基因敲除酵母菌和野生型酵母菌分别用无菌水进行梯度稀释，再将不同浓度梯度的酵母菌液点样于含30ug/mL刚果红（细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装，抑制酵母菌生长）的完全培养基上，培养适当时间后观察到的菌落生长情况如图2、图3。
综合上述实验结果，推测R基因敲除酵母菌絮凝能力变化的原因可能是______。
(5)若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒，请尝试提出一个还需要进一步研究的问题：______。
19．(1) PCR 目的基因是否导入受体细胞或目的基因是否转录出mRNA
(2) BamHⅠ、HindⅢ、DNA连接酶 抗生素G418
(3)是 R基因敲除后酵母菌的发酵能力不变，而絮凝能力增强
(4)R基因缺失增强了酵母菌对细胞壁抑制剂的耐性或R基因缺失减弱细胞壁抑制剂的危害或R基因敲除使菌株细胞壁组装能力提高
(5)R基因敲除菌株的食用安全性或R基因敲除菌株的遗传稳定性等
【分析】对目的基因分子水平上的检测通过PCR等技术检测受体细胞中是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；从受体细胞中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，检测目的基因是否翻译出相关蛋白等。
【详解】（1）过程①是对N和C片段的PCR扩增，PCR技术还可以用于检测目的基因是否导入受体细胞或目的基因是否转录出mRNA。
（2）过程②要对质粒进行切割，以及N片段、C片段与质粒的重组，因此用到的工具酶为限制酶BamH Ⅰ、HindⅢ，还需要DNA连接酶，过程③将构建的重组质粒线性化后转化进酵母菌，重组质粒上含有G基因，G基因为抗生素G418抗性基因，因此可以利用含抗生素G418的培养基筛选出重组酵母，最后挑取单菌落进一步筛选出R基因被敲除的酵母菌。
（3）由题干信息可知，酵母菌絮凝是指菌体细胞间通过细胞壁相互粘附、聚集成团的现象。适当提高酵母菌的絮凝能力，有助于发酵后细胞和产物的分离，节约生产成本。据图分析，野生型酵母菌和R基因敲除酵母菌的酒精发酵能力相同，但R基因敲除酵母菌的絮凝能力高于野生型酵母菌，因此R基因敲除酵母菌更符合生产需求。
（4）由图3可知，R基因敲除酵母菌比野生型酵母菌对刚果红的抵抗能力更强，刚果红为细胞壁抑制剂，破坏细胞壁的正常组装，抑制酵母菌生长，说明R基因敲除酵母菌可以抵抗细胞壁的破坏，即R基因缺失增强了酵母菌对细胞壁抑制剂的耐性或R基因缺失减弱细胞壁抑制剂的危害或R基因敲除使菌株细胞壁组装能力提高。
（5）若要将R基因敲除菌株应用于工业生产制作啤酒需要考虑R基因敲除菌株的食用安全性或R基因敲除菌株的遗传稳定性等问题。
20．（2023·湖北武汉·校联考模拟预测）胶原蛋白是一种生物性高分子物质，应用领域包括生医材料、化妆品、食品工业、研究用途等。随着科技的不断进步，可运用基因工程技术等进行胶原蛋白的生产重组，在先进技术驱动下，重组胶原蛋白生产量有所提升。回答下列问题：
(1)胶原蛋白由多个原胶原构成，由胶原蛋白基因控制合成。人胶原蛋白基因主要是从cDNA文库中获取，简要概述cDNA文库的构建过程：_____________。
(2)从理论上看，可利用转基因鼠来获得大量重组胶原蛋白。科学家已将αS1-乳腺酪蛋白基因片段及胶原蛋白基因片段进行基因工程重组，获得重组DNA分子。后续的操作是_____________，再将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物，转基因的雌鼠进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来获得所需的重组胶原蛋白。
(3)当前基因工程技术生产重组胶原蛋白，存在动植物细胞成本高、难度高的限制，无法实现规模化胶原蛋白生产，故从产业发展角度来看，宿主细胞选择微生物较为合适。微生物作为基因工程宿主细胞的优点有_____________（写两项）。利用大肠杆菌作宿主细胞，首先要用Ca处理，这一处理是否完成了转化? ____________，原因是____________。
(4)目前，通过基因工程获得的胶原蛋白与天然胶原蛋白相比，羟脯氨酸含量低。为此，可以通过蛋白质工程对____________进行改造，生产出与天然胶原蛋白一样的胶原蛋白，满足人们的生产和生活需求。
20．(1)提取细胞mRNA反转录（或逆转录）成多种cDNA，与载体连接后储存在受体菌群中
(2)将重组DNA分子导入受精卵
(3)结构简单、繁殖速度快、遗传物质少等 否（或没有） 转化指的目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，Ca2+处理使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子状态的感受态细胞，目的基因未进入受体细胞
(4)（胶原蛋白）基因
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
【详解】（1）cDNA文库的构建过程：提取细胞的mRNA，在逆转录酶的作用下以mRNA为模板，反转录（或逆转录）成多种cDNA，与载体连接后储存在受体菌群中。
（2）基因工程中动物受体细胞一般选择受精卵。获得重组DNA分子，将重组DNA分子导入受精卵，再将受精卵送入母体内，可获得转基因动物。
（3）微生物作为基因工程宿主细胞的优点有多为单细胞，结构简单，繁殖速度快，遗传物质少等。转化指的目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。Ca2+处理使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子状态的感受态细胞，目的基因未进入受体细胞。Ca2+处理并没有完成转化。
（4）蛋白质工程是对控制蛋白质合成的基因进行改造，从而实现对相应蛋白质的改变。通过基因工程获得的胶原蛋白与天然胶原蛋白相比，羟脯氨酸含量低。为此，可以通过蛋白质工程对（胶原蛋白）基因进行改造。
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