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解密14 基因工程（分层训练）-【高频考点解密】高考生物二轮复习讲义+分层训练（全国通用）
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解密14 基因工程 A组 基础练 1．（2020年北京高考生物试题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是（ ） A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测 B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术 C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合 D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物 【答案】A 【详解】A、由分析可知，该单抗不能直接用于新冠病毒的核酸检测，A错误；B、由题“针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，制备出全人源单克隆抗体”可知，在该单抗制备过程中利用了基因工程技术，B正确；C、针对新冠病毒表面抗原制备出的单抗，可与新冠病毒相应蛋白特异性结合，C正确；D、抗体基因表达产物检测的方法是采用抗原——抗体杂交反应，若呈阳性，则说明已翻译出相应的蛋白质，D正确。故选A。 2．（2020年山东省高考生物试卷（新高考））新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是（ ） A．抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理 B．感染早期，会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况 C．患者康复后，会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况 D．感染该病毒但无症状者，因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测 【答案】D 【详解】A、抗体只能与特定抗原结合，所以抗体检测法就利用了抗原与抗体特异性结合的原理，A正确；B、体液免疫需要经过一段时间才会产生抗体，所以感染早期会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况，B正确；C、机体通过产生较多的抗体从而将新冠病毒彻底消灭，故患者康复后，会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况，C正确；D、感染该病毒的部分人由于其机体自身免疫力强而未出现症状，但其仍发生相关免疫反应，故其体内也能产生抗体，D错误。故选D。 3．（2020年海南省高考生物试题（新高考））某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。 回答下列问题。 （1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_______________。 （2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_________；出现阴性反应者，胚胎为_________。 （3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。 【答案】雄性原核较大，更容易容纳外源DNA 引物 雄性小鼠 雌性小鼠 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功 【详解】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。 4．（2019年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ））基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。 （1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。 （2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。 （3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。 【答案】基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。 （3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。 5．（2019年海南省高考生物试卷）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。 （1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。 （2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。 （3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。 【答案】mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基 【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。 B组 提升练 1．（2020年北京高考生物试题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。故选B。 2．（2020年浙江省高考生物试卷）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 【答案】D 【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。故选D。 3．（2021年河北高考生物试卷（新高考））采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。 （3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。 （4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。 【答案】基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。 4．（2020年北京高考生物试题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为____________________。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用__________。（举一例） 【答案】多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。（3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。 5．（2020年山东省高考生物试卷（新高考））水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 （1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。 （2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。 （3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。 （4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。 【答案】限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 【详解】（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。 6．（2020年天津高考生物试卷）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。 据图回答： （1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。 （2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。 A．引入短肽编码序列不能含终止子序列 B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列 C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列 D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性 （3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。 （4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是________________________________。 （5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________。 A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞 【答案】6 ABCD 3 核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 AB 【详解】（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。 7．（2020年江苏省高考生物试卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）： 请据图回答问题： （1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。 （2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。 （3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。 （4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。 A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′ B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′ C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′ D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′ 【答案】限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B 【详解】（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。 8．（2019年天津市高考生物试卷）作物M的F1基因杂合，具有优良性状。F1自交形成自交胚的过程见途径1（以两对同源染色体为例）。改造F1相关基因，获得具有与F1优良性状一致的N植株，该植株在形成配子时，有丝分裂替代减数分裂，其卵细胞不能受精，直接发育成克隆胚，过程见途径2。据图回答： （1）与途径1相比，途径2中N植株形成配子时由于有丝分裂替代减数分裂，不会发生由__________和_____________________________导致的基因重组，也不会发生染色体数目________________。 （2）基因杂合是保持F1优良性状的必要条件。以n对独立遗传的等位基因为例，理论上，自交胚与F1基因型一致的概率是________________，克隆胚与N植株基因型一致的概率是____________。通过途径___________获得的后代可保持F1的优良性状。 【答案】同源染色体非姐妹染色单体交叉互换 非同源染色体自由组合 减半 1/2n 100% 2 【详解】（1）途径1是通过减数分裂形成配子，而途径2中通过有丝分裂产生配子，有丝分裂过程中不发生基因重组，且子细胞中染色体数不减半，故与途径1相比，途径2中N植株形成配子时不会发生同源染色体非姐妹染色单体的交叉互换和非同源染色体的自由组合，也不会发生染色体数目减半。（2）由题意可知，要保持F1优良性状需要基因杂合，一对杂合基因的个体自交获得杂合子的概率是1/2，若该植株有n对独立遗传的等位基因，根据自由组合定律，杂合子自交子代中每对基因均杂合的概率为1/2n，故自交胚与F1基因型（基因杂合）一致的概率为1/2n。而克隆胚的形成相当于无性繁殖过程，子代和N植株遗传信息一致，故克隆胚与N植株基因型一致的概率是100%。（3）途径1产生自交胚的过程存在基因重组，F1产生的配子具有多样性，经受精作用后的子代具有多样性，不可保持F1的优良性状；而途径2产生克隆胚的过程不存在基因重组，子代和亲本的遗传信息一致，可以保持F1的优良性状。 9．（浙江省2019届高三4月选考生物试题）回答下列（二）小题： （二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 （2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。 （3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 （4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。 【答案】单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养 【详解】（二）（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。 10．为了研究低温诱导对某基因的启动子 P 活性的影响，科研人员进行了启动子 P的 PCR 提取、特定表达载体的构建和转基因烟草的功能鉴定。该基因及其启动子 P 的结构及相应限制酶的切割位点如下图所示，图中灰色区域碱基序列是已知的，启动子 P（图中黑 色区域）及上游碱基序列未知，片段 I 和片段 II 中的字母 A~F 均表示引物。请回答下列问题。 （1）启动子是_____的位点。不能直接根据片段 I 扩增启动子 P 的原因 是 ________。 （2）为了能扩增正常启动子 P，科研人员先用_____酶处理上图中的片段 I，使片段 I 成为环状 DNA；再将环状 DNA 用 ______（填“酶 1”或“酶 2”）处理得到了片段 II，如下图 所示。根据片段 II 能不能扩增出启动子 P？若能，请写出可选用的引物组合（用 C、D、E、 F 表示），若不能请说明理由______。 （3）已知卡那霉素可抑制烟草细胞的生长，基因 M 可在烟草的根部正常表达，其表达产物 可将 X－Gluc 水解生成蓝色物质。将启动子 P 和基因 M 结合并与含有卡那霉素抗性基因的 Ti－质粒重组构建基因表达载体。将表达载体导入农杆菌并与酚类物质混合后加入含有烟草 细胞的培养基中，再用含有________的培养基筛选出所需的烟草细胞，然后经过________获得转基因烟草植株。 （4）将上述转基因烟草植株分为 A、B 两组，A 组在常温（25℃，对照组）下培养，B 组在 低温（4℃，实验组）下培养，一段时间后取 A、B 的幼根，浸入适量_____溶液中，观 察烟草细胞中基因 M 的表达情况（表达强度越大，细胞表现的蓝色越深）。若 A、B 组的结 果分别为_____，则说明低温抑制启动子 P 的功能。 【答案】RNA聚合酶识别并结合 启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物 酶1和DNA连接 酶2 能，可选用的引物组合是D和E 卡那霉素 组织培养 X－Gluc A蓝色较深、B蓝色较浅 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于基因的转录；由于启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物，故不能直接根据片段Ⅰ扩增启动子。（2）结合分析可知，图中的片段I在启动子P的左右两端各有一个酶1的切割位点，酶1可切割启动子P的左右两端产生相同的末端，再用DNA连接酶连接可形成环状DNA的片段I；片段II的首尾两端都有灰色区域，结合题图分析可知，片段II是用酶2切割处理环状DNA产生的；由于子链合成方向是从子链的5'-3'，所以可以用引物D和E扩增出启动子P。（3）结合题干信息“卡那霉素可抑制烟草细胞的生长”及“基因 M 可在烟草的根部正常表达，其表达产物 可将 X－Gluc 水解生成蓝色物质”可知，用含有卡那霉素和X-Gluc的培养基可筛选出所需的烟草细胞，在卡那霉素中能存活说明获得了质粒，能将X-Gluc水解成蓝色说明获得了基因M；筛选出的烟草细胞经过植物组织培养可获得转基因植株。（4）由题意可知，基因M可在烟草的根部正常表达，其表达产物可将X－Gluc水解生成蓝色物质，故可用适量X－Gluc溶液检测A、B的幼根细胞中基因M的表达情况；表达强度越大，细胞表现的蓝色越深。若A组蓝色深而B组蓝色较浅，则说明B组低温使启动子P受抑制，表达的产物少。 11．（2021·宁夏·银川一中高三阶段练习）某科学实验室专门为城市农业培育了像葡萄一样的小番茄，这种小番茄也适合在太空种植。科学家利用基因突变将控制生长的终止基因（SP）改造为SP1基因，利用基因敲除（将同源DNA片段导人受体细胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段）的方法使小番茄的成熟期缩短为40天。如图为SP1基因两端的序列和质粒中相关的序列，已知限制酶I的识别序列和切点是－G↓GATCC，限制酶II的识别序列和切点是－↓GATC。 回答下列问题： （1）构建基因表达载体时，需使用______________（填“限制酶I”或“限制酶II”）切割质粒。目的基因的首端是启动子，启动子在基因中的作用是_____________，驱动基因转录出mRNA。 （2）利用SP1基因敲除SP基因属于生物变异中的_____________，敲除SP基因后的受体细胞需要经组织培养形成完整个体，其中再分化的实质是_____________。 （3）科研人员提取愈伤组织细胞的所有RNA后，先获得cDNA，再进行PCR扩增，但最终未能检测出SP1基因，其可能原因是_______。在个体生物学水平上，SP基因成功表达的鉴定标准为________ 。 （4）转基因技术是一把双刃剑，引发人们在________安全、_______安全、_______安全三个方面发生激烈的争论。 【答案】限制酶Ⅰ RNA聚合酶识别和结合的部位 基因重组 基因的选择性表达 SP1基因未能导入受体细胞或导入受体细胞的SP1基因未能转录 小番茄的成熟期约为40天 食物 生物 环境 【详解】（1）要构建基因表达载体，需要质粒上至少有1个标记基因，如果质粒用限制酶Ⅱ处理，那么geneⅠ和geneⅡ都会被切断，质粒变成了两段线性序列，用限制酶Ⅰ切割只能在geneⅡ上切开一个切口，所以质粒用限制酶Ⅰ切割。启动子在基因中的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，从而驱动基因转录出mRNA。（2）利用SP1基因敲除SP基因，并未改变基因的结构，而是将整个基因插入，使目的基因与染色体上原有基因进行了重新组合，属于基因重组。植物组织培养经过脱分化、再分化过程，脱分化的实质是使不分裂的细胞恢复分裂能力；再分化的实质是基因选择性表达的结果。（3）提取的愈伤组织细胞的RNA通过逆转录过程得到DNA；最终未能检测出SP1基因，可能是因为SP1基因未能导入番茄细胞或导入番茄细胞的SP1基因未能转录。SP1基因能够缩短小番茄的成熟时间，若成功表达，则小番茄的成熟期约为40天。（4）转基因技术是一把双刃剑，引发人们在食物安全、生物安全、环境安全三个方面发生激烈的争论。 12．（2021·福建福州·一模）新冠病毒S蛋白与其侵染宿主细胞密切相关，疫苗的研究与生产有多种途径，回答以下问题。 （1）我国目前已上市的灭活新冠疫苗，是利用Vero细胞（非洲绿猴的肾脏上皮细胞）对病毒进行增殖后灭活，因此需对Vero细胞进行大量培养。传代培养时需利用胰蛋白酶使细胞分散开并制成____________。对病毒灭活是指利用物理或化学手使病原体失去感染能力，但保留原来的____________结构。 （2）S蛋白的RBD多肽区域是新冠病毒感染宿主细胞的关键。研究人员现利用基因工程技术生产S蛋白的RBD多肽片段制作重组蛋白疫苗。基本过程如下图所示： （注：LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则成白色。） ①提取新冠病毒RINA经过____________得到的cDNA，经____________技术扩增得到RBD基因，与克隆质粒pUC质粒连接，并接种到添加____________的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为____________的菌落用液体培养扩大培养，提取重组质PUC-RBD。 ②接下来应用对pUC-RBD进行酶切获得RBD基因，并与BamHⅠ酶和XhoⅠ酶切后的载体pET质粒连接。但RBD基因序列两端无相应限制酶酶切位点，现欲利用RCR技术对RBD基因进行扩增同时在其上下游区域增补上相应限制酶的识别序列，则根据下表，PCR时所用的上下游引物应分别添加的序列是____________。 ③构建好的基因表达载体再次导入大肠杆菌培养，要检测最终是否表达了S蛋白的RBD区域，可以加入____________进行检测。 （3）有研究表明，现有的疫苗对新出现的变异类型病毒仍具有预防效果，原因是________________________。 【答案】细胞悬浮液 抗原 逆转录 PCR 氨苄青霉素和X-gal 白色 5’-GGATCC-3’和5’CTCGAG-3’ RBD抗体 与原有新冠病毒的抗原结构相似 【详解】（1）传代培养：是指需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再进行培养的过程，细胞传代培养过程中需要用胰蛋白酶处理后使其变成单个细胞并制备成细胞悬浮液，有利于继续培养细胞，病毒灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法；（2）①新冠病毒是RNA病毒，需要通过逆转录酶的催化才能反转录成其cDNA，cDNA通过PCR技术获得大量的扩增，RBD基因与pUC质粒重组得到的pUC-RBD重组质粒转入大肠杆菌后，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此接种到含氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，筛选出含有目的基因的大肠杆菌，质粒中有LacZ基因，如果质粒转入了大肠杆菌会破坏LacZ基因，使得菌落呈现白色；②pET质粒中有BamHⅠ和XhoI的酶切位点，所以在目的基因两端应增补上相应限制酶的识别序列：5’-GGATCC-3’和5’CTCGAG-3’； ③构建好的基因表达载体再次导入大肠杆菌培养，要检测最终是否表达了S蛋白的RBD区域，可以加入RBD进行抗原抗体配对检测；（3）因为变异的病毒的抗原也没有大量改变，与原有新冠病毒的抗原结构相似，因此现有的抗体仍然可以与变异病毒结合，达到预防的目的。 13．（2021·浙江·高三专题练习）回答下列（二）两个小题： （二）植物被野生型农杆菌感染后会产生瘤状结构（类似愈伤组织），主要原因是农杆菌的Ti质粒中含有生长素合成基因（A）、细胞分裂素合成基因（B）和冠瘿碱合成基因（C）。已知T－DNA上的基因在农杆菌中不表达，在植物细胞中可以表达。冠瘿碱是农杆菌生命活动必需的有机物质。黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因导入棉花，获得抗黄萎病棉花。下图为农杆菌Ti质粒的T－DNA区段结构示意图，据图回答问题： （1）获得碱基序列未知的抗黄萎病基因，可通过____________方法。构建重组Ti质粒时，需要用两种不同的限制酶切割目的基因和Ti质粒，目的是__________。 （2）为防止农杆菌侵染植物细胞时大量繁殖，导致植物细胞死亡，抗黄萎病基因必须把T—DNA片段上的基因__________（用字母表示）替换掉。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内，加入液体培养基，并置于摇床上__________振荡培养一段时间，从而完成转化实验。 （3）若棉花体细胞对农杆菌不敏感，还可以采用____________法，将目的基因导入受体细胞的细胞核。通常将重组细胞直接接种在适宜的培养基上进行组织培养，该培养基以MS培养基为基础，还需要加入适当种类和比例的植物生长调节剂、琼脂、水和____________。丛状苗分株培养后，为促使其生根，可通过____________无机物的浓度实现。 【答案】从基因文库中获取 防止目的基因和质粒自身环化，防止反向连接 基因A、B、C 慢速 显微注射 蔗糖 降低 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′限制酶BamHⅠHindⅢXhoIXbaI识别序列5'-GGATCC-3'5'-AAGCTT-3'5'-CTCGAG-3'5'-TCTAGA-3'
解密14 基因工程 A组 基础练 1．（2020年北京高考生物试题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是（ ） A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测 B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术 C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合 D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物 【答案】A 【详解】A、由分析可知，该单抗不能直接用于新冠病毒的核酸检测，A错误；B、由题“针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，制备出全人源单克隆抗体”可知，在该单抗制备过程中利用了基因工程技术，B正确；C、针对新冠病毒表面抗原制备出的单抗，可与新冠病毒相应蛋白特异性结合，C正确；D、抗体基因表达产物检测的方法是采用抗原——抗体杂交反应，若呈阳性，则说明已翻译出相应的蛋白质，D正确。故选A。 2．（2020年山东省高考生物试卷（新高考））新型冠状病毒的检测方法目前主要有核酸检测法和抗体检测法。下列说法错误的是（ ） A．抗体检测法利用了抗原与抗体特异性结合的原理 B．感染早期，会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况 C．患者康复后，会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况 D．感染该病毒但无症状者，因其体内不能产生抗体不适用抗体检测法检测 【答案】D 【详解】A、抗体只能与特定抗原结合，所以抗体检测法就利用了抗原与抗体特异性结合的原理，A正确；B、体液免疫需要经过一段时间才会产生抗体，所以感染早期会出现能检测出核酸而检测不出抗体的情况，B正确；C、机体通过产生较多的抗体从而将新冠病毒彻底消灭，故患者康复后，会出现能检测出抗体而检测不出核酸的情况，C正确；D、感染该病毒的部分人由于其机体自身免疫力强而未出现症状，但其仍发生相关免疫反应，故其体内也能产生抗体，D错误。故选D。 3．（2020年海南省高考生物试题（新高考））某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。 回答下列问题。 （1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_______________。 （2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计__________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_________；出现阴性反应者，胚胎为_________。 （3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。 【答案】雄性原核较大，更容易容纳外源DNA 引物 雄性小鼠 雌性小鼠 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功 【详解】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。 4．（2019年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ））基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。 （1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。 （2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。 （3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。 【答案】基因组文库 cDNA文库 解旋酶 加热至90-95℃ 氢键 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 【详解】（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库(CDNA文库)，前者包括一种生物的全部基因，后者只包括一种生物的部分基因。（2）体内进行DNA复制时，需要解旋酶和DNA聚合酶，解旋酶可以打开双链之间的氢键， DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时，利用高温变性即加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。 （3）由于在PCR过程中，需要不断的改变温度，该过程中涉及较高温度处理变性，大肠杆菌细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活，因此PCR过程中需要用耐高温的Taq DNA聚合酶催化。 5．（2019年海南省高考生物试卷）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。 （1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。 （2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。 （3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。 【答案】mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基 【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。 B组 提升练 1．（2020年北京高考生物试题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。故选B。 2．（2020年浙江省高考生物试卷）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ） A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 【答案】D 【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。故选D。 3．（2021年河北高考生物试卷（新高考））采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。 回答下列问题： （1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为__________。 （2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是__________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________________。 （3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________。 （4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的__________（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的__________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。 （5）已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于___________（写出两点即可）。 【答案】基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用 【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。 4．（2020年北京高考生物试题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 （1）纤维素属于__________糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是__________。 （2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为____________________。 （3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是__________。 （4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为____________________。 （5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用__________。（举一例） 【答案】多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染 【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。（3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。 5．（2020年山东省高考生物试卷（新高考））水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 （1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_____________。 （2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了______，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列___ (填：发生或不发生)改变，原因是_____________。 （3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_____________。 （4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_____，原因是_____________。 【答案】限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 【详解】（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。 6．（2020年天津高考生物试卷）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。 据图回答： （1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。 （2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________。 A．引入短肽编码序列不能含终止子序列 B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列 C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列 D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性 （3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。 （4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是________________________________。 （5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________。 A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞 【答案】6 ABCD 3 核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 AB 【详解】（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。 7．（2020年江苏省高考生物试卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）： 请据图回答问题： （1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。 （2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。 （3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。 （4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。 A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′ B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′ C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′ D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′ 【答案】限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B 【详解】（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。 8．（2019年天津市高考生物试卷）作物M的F1基因杂合，具有优良性状。F1自交形成自交胚的过程见途径1（以两对同源染色体为例）。改造F1相关基因，获得具有与F1优良性状一致的N植株，该植株在形成配子时，有丝分裂替代减数分裂，其卵细胞不能受精，直接发育成克隆胚，过程见途径2。据图回答： （1）与途径1相比，途径2中N植株形成配子时由于有丝分裂替代减数分裂，不会发生由__________和_____________________________导致的基因重组，也不会发生染色体数目________________。 （2）基因杂合是保持F1优良性状的必要条件。以n对独立遗传的等位基因为例，理论上，自交胚与F1基因型一致的概率是________________，克隆胚与N植株基因型一致的概率是____________。通过途径___________获得的后代可保持F1的优良性状。 【答案】同源染色体非姐妹染色单体交叉互换 非同源染色体自由组合 减半 1/2n 100% 2 【详解】（1）途径1是通过减数分裂形成配子，而途径2中通过有丝分裂产生配子，有丝分裂过程中不发生基因重组，且子细胞中染色体数不减半，故与途径1相比，途径2中N植株形成配子时不会发生同源染色体非姐妹染色单体的交叉互换和非同源染色体的自由组合，也不会发生染色体数目减半。（2）由题意可知，要保持F1优良性状需要基因杂合，一对杂合基因的个体自交获得杂合子的概率是1/2，若该植株有n对独立遗传的等位基因，根据自由组合定律，杂合子自交子代中每对基因均杂合的概率为1/2n，故自交胚与F1基因型（基因杂合）一致的概率为1/2n。而克隆胚的形成相当于无性繁殖过程，子代和N植株遗传信息一致，故克隆胚与N植株基因型一致的概率是100%。（3）途径1产生自交胚的过程存在基因重组，F1产生的配子具有多样性，经受精作用后的子代具有多样性，不可保持F1的优良性状；而途径2产生克隆胚的过程不存在基因重组，子代和亲本的遗传信息一致，可以保持F1的优良性状。 9．（浙江省2019届高三4月选考生物试题）回答下列（二）小题： （二）回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题： （1）通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白（可作为抗原），可通过______技术获得特异性探针，并将______中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。 （2）将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测______（A．质粒载体 B．转录产物 C．抗性基因 D．病原微生物）。 （3）植物细胞在培养过程中往往会发生______，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入______，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。 （4）用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是______。 【答案】单克隆抗体 基因文库 B 变异 高浓度致病真菌 花粉离体 胚的离体培养 【详解】（二）（1）抗病蛋白可作抗原，则特异性探针应为抗体，则需要通过单克隆抗体技术获得特异性探针；基因文库包含了某个DNA分子的所有基因，故是将基因文库中的所有基因进行表达，再利用探针获得目的基因；（2）质粒载体只能检测目的基因是否转入受体细胞，A选项错误；转录产物为RNA，可以通过DNA-RNA分子杂交检测抗病基因是否表达，B选项正确；检测抗性基因只能检测抗性基因是否导入受体细胞，无法检测该基因是否表达，C选项错误；检测病原微生物是个体水平检测目的基因是否表达的方式，D选项错误；故正确的选项选择B；（3）抗致病真菌基因是原本植物细胞不含的基因，则需要利用植物细胞在培养过程中的变异来筛选抗致病真菌能力强的细胞；由于需要筛选抗致病真菌能力强的细胞，故需要在培养基中加入高浓度致病真菌；快速稳定遗传的抗病植株需要通过单倍体培养获得，故需要利用花粉离体培养建立细胞系用于筛选；（4）要利用胚的发育获得植株，可利用胚细胞的全能性，采用胚的离体培养获得植株。 10．为了研究低温诱导对某基因的启动子 P 活性的影响，科研人员进行了启动子 P的 PCR 提取、特定表达载体的构建和转基因烟草的功能鉴定。该基因及其启动子 P 的结构及相应限制酶的切割位点如下图所示，图中灰色区域碱基序列是已知的，启动子 P（图中黑 色区域）及上游碱基序列未知，片段 I 和片段 II 中的字母 A~F 均表示引物。请回答下列问题。 （1）启动子是_____的位点。不能直接根据片段 I 扩增启动子 P 的原因 是 ________。 （2）为了能扩增正常启动子 P，科研人员先用_____酶处理上图中的片段 I，使片段 I 成为环状 DNA；再将环状 DNA 用 ______（填“酶 1”或“酶 2”）处理得到了片段 II，如下图 所示。根据片段 II 能不能扩增出启动子 P？若能，请写出可选用的引物组合（用 C、D、E、 F 表示），若不能请说明理由______。 （3）已知卡那霉素可抑制烟草细胞的生长，基因 M 可在烟草的根部正常表达，其表达产物 可将 X－Gluc 水解生成蓝色物质。将启动子 P 和基因 M 结合并与含有卡那霉素抗性基因的 Ti－质粒重组构建基因表达载体。将表达载体导入农杆菌并与酚类物质混合后加入含有烟草 细胞的培养基中，再用含有________的培养基筛选出所需的烟草细胞，然后经过________获得转基因烟草植株。 （4）将上述转基因烟草植株分为 A、B 两组，A 组在常温（25℃，对照组）下培养，B 组在 低温（4℃，实验组）下培养，一段时间后取 A、B 的幼根，浸入适量_____溶液中，观 察烟草细胞中基因 M 的表达情况（表达强度越大，细胞表现的蓝色越深）。若 A、B 组的结 果分别为_____，则说明低温抑制启动子 P 的功能。 【答案】RNA聚合酶识别并结合 启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物 酶1和DNA连接 酶2 能，可选用的引物组合是D和E 卡那霉素 组织培养 X－Gluc A蓝色较深、B蓝色较浅 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于基因的转录；由于启动子P及左侧的序列未知，无法合成PCR所需要的引物，故不能直接根据片段Ⅰ扩增启动子。（2）结合分析可知，图中的片段I在启动子P的左右两端各有一个酶1的切割位点，酶1可切割启动子P的左右两端产生相同的末端，再用DNA连接酶连接可形成环状DNA的片段I；片段II的首尾两端都有灰色区域，结合题图分析可知，片段II是用酶2切割处理环状DNA产生的；由于子链合成方向是从子链的5'-3'，所以可以用引物D和E扩增出启动子P。（3）结合题干信息“卡那霉素可抑制烟草细胞的生长”及“基因 M 可在烟草的根部正常表达，其表达产物 可将 X－Gluc 水解生成蓝色物质”可知，用含有卡那霉素和X-Gluc的培养基可筛选出所需的烟草细胞，在卡那霉素中能存活说明获得了质粒，能将X-Gluc水解成蓝色说明获得了基因M；筛选出的烟草细胞经过植物组织培养可获得转基因植株。（4）由题意可知，基因M可在烟草的根部正常表达，其表达产物可将X－Gluc水解生成蓝色物质，故可用适量X－Gluc溶液检测A、B的幼根细胞中基因M的表达情况；表达强度越大，细胞表现的蓝色越深。若A组蓝色深而B组蓝色较浅，则说明B组低温使启动子P受抑制，表达的产物少。 11．（2021·宁夏·银川一中高三阶段练习）某科学实验室专门为城市农业培育了像葡萄一样的小番茄，这种小番茄也适合在太空种植。科学家利用基因突变将控制生长的终止基因（SP）改造为SP1基因，利用基因敲除（将同源DNA片段导人受体细胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段）的方法使小番茄的成熟期缩短为40天。如图为SP1基因两端的序列和质粒中相关的序列，已知限制酶I的识别序列和切点是－G↓GATCC，限制酶II的识别序列和切点是－↓GATC。 回答下列问题： （1）构建基因表达载体时，需使用______________（填“限制酶I”或“限制酶II”）切割质粒。目的基因的首端是启动子，启动子在基因中的作用是_____________，驱动基因转录出mRNA。 （2）利用SP1基因敲除SP基因属于生物变异中的_____________，敲除SP基因后的受体细胞需要经组织培养形成完整个体，其中再分化的实质是_____________。 （3）科研人员提取愈伤组织细胞的所有RNA后，先获得cDNA，再进行PCR扩增，但最终未能检测出SP1基因，其可能原因是_______。在个体生物学水平上，SP基因成功表达的鉴定标准为________ 。 （4）转基因技术是一把双刃剑，引发人们在________安全、_______安全、_______安全三个方面发生激烈的争论。 【答案】限制酶Ⅰ RNA聚合酶识别和结合的部位 基因重组 基因的选择性表达 SP1基因未能导入受体细胞或导入受体细胞的SP1基因未能转录 小番茄的成熟期约为40天 食物 生物 环境 【详解】（1）要构建基因表达载体，需要质粒上至少有1个标记基因，如果质粒用限制酶Ⅱ处理，那么geneⅠ和geneⅡ都会被切断，质粒变成了两段线性序列，用限制酶Ⅰ切割只能在geneⅡ上切开一个切口，所以质粒用限制酶Ⅰ切割。启动子在基因中的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，从而驱动基因转录出mRNA。（2）利用SP1基因敲除SP基因，并未改变基因的结构，而是将整个基因插入，使目的基因与染色体上原有基因进行了重新组合，属于基因重组。植物组织培养经过脱分化、再分化过程，脱分化的实质是使不分裂的细胞恢复分裂能力；再分化的实质是基因选择性表达的结果。（3）提取的愈伤组织细胞的RNA通过逆转录过程得到DNA；最终未能检测出SP1基因，可能是因为SP1基因未能导入番茄细胞或导入番茄细胞的SP1基因未能转录。SP1基因能够缩短小番茄的成熟时间，若成功表达，则小番茄的成熟期约为40天。（4）转基因技术是一把双刃剑，引发人们在食物安全、生物安全、环境安全三个方面发生激烈的争论。 12．（2021·福建福州·一模）新冠病毒S蛋白与其侵染宿主细胞密切相关，疫苗的研究与生产有多种途径，回答以下问题。 （1）我国目前已上市的灭活新冠疫苗，是利用Vero细胞（非洲绿猴的肾脏上皮细胞）对病毒进行增殖后灭活，因此需对Vero细胞进行大量培养。传代培养时需利用胰蛋白酶使细胞分散开并制成____________。对病毒灭活是指利用物理或化学手使病原体失去感染能力，但保留原来的____________结构。 （2）S蛋白的RBD多肽区域是新冠病毒感染宿主细胞的关键。研究人员现利用基因工程技术生产S蛋白的RBD多肽片段制作重组蛋白疫苗。基本过程如下图所示： （注：LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则成白色。） ①提取新冠病毒RINA经过____________得到的cDNA，经____________技术扩增得到RBD基因，与克隆质粒pUC质粒连接，并接种到添加____________的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为____________的菌落用液体培养扩大培养，提取重组质PUC-RBD。 ②接下来应用对pUC-RBD进行酶切获得RBD基因，并与BamHⅠ酶和XhoⅠ酶切后的载体pET质粒连接。但RBD基因序列两端无相应限制酶酶切位点，现欲利用RCR技术对RBD基因进行扩增同时在其上下游区域增补上相应限制酶的识别序列，则根据下表，PCR时所用的上下游引物应分别添加的序列是____________。 ③构建好的基因表达载体再次导入大肠杆菌培养，要检测最终是否表达了S蛋白的RBD区域，可以加入____________进行检测。 （3）有研究表明，现有的疫苗对新出现的变异类型病毒仍具有预防效果，原因是________________________。 【答案】细胞悬浮液 抗原 逆转录 PCR 氨苄青霉素和X-gal 白色 5’-GGATCC-3’和5’CTCGAG-3’ RBD抗体 与原有新冠病毒的抗原结构相似 【详解】（1）传代培养：是指需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内，再进行培养的过程，细胞传代培养过程中需要用胰蛋白酶处理后使其变成单个细胞并制备成细胞悬浮液，有利于继续培养细胞，病毒灭活是指用物理或化学手段杀死病毒、细菌等，但是不损害它们体内有用抗原的方法；（2）①新冠病毒是RNA病毒，需要通过逆转录酶的催化才能反转录成其cDNA，cDNA通过PCR技术获得大量的扩增，RBD基因与pUC质粒重组得到的pUC-RBD重组质粒转入大肠杆菌后，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此接种到含氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，筛选出含有目的基因的大肠杆菌，质粒中有LacZ基因，如果质粒转入了大肠杆菌会破坏LacZ基因，使得菌落呈现白色；②pET质粒中有BamHⅠ和XhoI的酶切位点，所以在目的基因两端应增补上相应限制酶的识别序列：5’-GGATCC-3’和5’CTCGAG-3’； ③构建好的基因表达载体再次导入大肠杆菌培养，要检测最终是否表达了S蛋白的RBD区域，可以加入RBD进行抗原抗体配对检测；（3）因为变异的病毒的抗原也没有大量改变，与原有新冠病毒的抗原结构相似，因此现有的抗体仍然可以与变异病毒结合，达到预防的目的。 13．（2021·浙江·高三专题练习）回答下列（二）两个小题： （二）植物被野生型农杆菌感染后会产生瘤状结构（类似愈伤组织），主要原因是农杆菌的Ti质粒中含有生长素合成基因（A）、细胞分裂素合成基因（B）和冠瘿碱合成基因（C）。已知T－DNA上的基因在农杆菌中不表达，在植物细胞中可以表达。冠瘿碱是农杆菌生命活动必需的有机物质。黄萎病是危害棉花种植的常见疾病，科学家通过基因工程技术将抗黄萎病基因导入棉花，获得抗黄萎病棉花。下图为农杆菌Ti质粒的T－DNA区段结构示意图，据图回答问题： （1）获得碱基序列未知的抗黄萎病基因，可通过____________方法。构建重组Ti质粒时，需要用两种不同的限制酶切割目的基因和Ti质粒，目的是__________。 （2）为防止农杆菌侵染植物细胞时大量繁殖，导致植物细胞死亡，抗黄萎病基因必须把T—DNA片段上的基因__________（用字母表示）替换掉。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内，加入液体培养基，并置于摇床上__________振荡培养一段时间，从而完成转化实验。 （3）若棉花体细胞对农杆菌不敏感，还可以采用____________法，将目的基因导入受体细胞的细胞核。通常将重组细胞直接接种在适宜的培养基上进行组织培养，该培养基以MS培养基为基础，还需要加入适当种类和比例的植物生长调节剂、琼脂、水和____________。丛状苗分株培养后，为促使其生根，可通过____________无机物的浓度实现。 【答案】从基因文库中获取 防止目的基因和质粒自身环化，防止反向连接 基因A、B、C 慢速 显微注射 蔗糖 降低 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′限制酶BamHⅠHindⅢXhoIXbaI识别序列5'-GGATCC-3'5'-AAGCTT-3'5'-CTCGAG-3'5'-TCTAGA-3'
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