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39 2022年高考生物一轮复习（新高考版2(鲁辽)适用） 第十单元 第39讲 基因工程
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第39讲 基因工程
[目标要求] 1.阐明重组DNA技术所需三种工具的作用。2.概述“DNA的粗提取与鉴定”实验的原理与方法。3.阐明基因工程的基本操作程序及方法。4.举例说明基因工程的应用。5.概述蛋白质工程的原理及步骤。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基本工具
(1)限制性内切核酸酶
特别提醒 将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
教材中的隐性知识 源于选择性必修3 P71“旁栏思考”
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
②类型
常用类型
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
教材中的隐性知识 源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(2)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(3)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(4)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( × )
(5)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(6)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( × )
(1)不同种生物的基因能拼接的理论基础是：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)外源基因在受体细胞内能表达的理论基础是：①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界共用一套遗传密码。
1．与DNA有关的酶的比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
考向一 基因工程工具酶的应用
1．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是( )
A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
答案 A
2．某质粒载体的结构如图所示。现有BamHⅠ、MboⅠ、PalⅠ三种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、↓GATC、GG↓CC。已知目的基因的两端均有后两种限制酶的识别序列。回答下列问题：
(1)从表达载体的组成上看，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因属于______________。通常该结构必须具备的特性有：表达产物对细胞无害、表达产物及产物的功能便于检测、表达产物及产物的功能在受体细胞中本身________(填“不存在”或“已存在”)。
(2)上述三种限制酶中，能切割产生平末端的酶是________，能切割产生相同黏性末端的酶是________________________________________________________________________。
(3)若将质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，应选用的限制酶是______________(填“MboⅠ”或“PalⅠ”)。不选用另一种酶的原因是______________
________________________________________________________________________。
答案 (1)标记基因 不存在 (2)PalⅠ BamHⅠ、MboⅠ (3)PalⅠ 若用MboⅠ处理会破坏质粒中的两个标记基因，不利于重组DNA分子的筛选
考向二 基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细菌拟核DNA之外的细胞质中
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案 C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①根据已知结构和功能进行筛选。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①构建基因文库获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物
种类
植物
动物
微生物
常用
方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体
细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
RCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
如抗虫、抗病的接种实验
(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因( × )
(2)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( √ )
(3)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( √ )
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( √ )
(5)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达( × )
据图回答问题：
构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子及标记基因等。图中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
1．PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
2．基因表达载体构建过程
如果用同一种限制酶切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
考向一 目的基因的获取
5．(2020·中国人民大学附中高三摸底)在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是( )
A．引物1与引物2 B．引物3与引物4
C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
答案 C
解析 要获得B链，则需要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
6．下列关于利用PCR技术扩增目的基因的叙述，正确的是( )
A．PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使核糖核苷酸序列呈指数形式增加
B．在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种双链引物
C．目的基因的扩增依赖于模板、耐高温的DNA聚合酶和原料等物质
D．加热至90 ℃以上的目的是使目的基因的磷酸二酯键断裂
答案 C
解析 PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使脱氧核苷酸序列呈指数形式增加，A错误；在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，B错误；PCR过程中，每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，在扩增过程中需依赖目的基因为模板、耐高温的DNA聚合酶和相应原料(脱氧核糖核苷酸)等物质，C正确；加热至90 ℃以上的目的是使目的基因的两条链断开，因此高温破坏的是两条链间的氢键，D错误。
考向二 基因工程的基本操作程序
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物细胞的基因组中。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
答案 D
解析 目的基因应插入T－DNA片段上，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞；若受体细胞为原核生物，常采用Ca2＋处理，使原核细胞成为感受态细胞；Ti质粒分布在细菌拟核DNA之外。
8．(2017·全国Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了______________________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是___________________________________。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案 (1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 四种游离的脱氧核苷酸 (3)①进行细胞传代培养 维持培养箱中的pH ②C
解析 (1)因为编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子，因此所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)PCR技术扩增目的基因的条件需要：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶。序列甲作为模板DNA，DNA的原料为四种游离的脱氧核苷酸。
(3)①动物细胞可以通过细胞培养(传代培养)继续增殖。细胞培养过程中，需要气体环境，其中气体CO2的作用是维持培养箱中的pH。②分析坐标图：对比甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况发现：最终效果相当，只是增殖时间不同，可以推断出A、E片段编码的肽段不会降低T淋巴细胞增殖效果。将丙蛋白分别与甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况比较发现：丙蛋白降低了T淋巴细胞增殖。丙序列与甲和乙序列相比较，缺少了C片段，也就是说若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
9．据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病。这种技术把选定的X基因导入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素。请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为__________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、____________、4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用____________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)目的基因 引物 模板DNA (2)基因表达载体的构建 质粒 DNA连接酶 (3)PCR 实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程的应用
表现方面
具体内容
在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；⑥改善畜产品的品质
在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造来生产药物；②利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物；③用转基因动物作器官移植供体
在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
特别提醒 (1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：改造或合成基因。
③结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
(3)蛋白质工程的应用
①利用蛋白质工程研发药物。
②利用蛋白质工程改进或开发新的工业酶。
③在农业方面，改造光合作用相关的酶。
(1)转基因抗病农作物不需要使用农药( × )
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质( √ )
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质( √ )
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
(源于选择性必修3 P91“正文”)利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
1．乳腺生物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子。
(3)受体细胞：哺乳动物的受精卵。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3．蛋白质工程与基因工程的异同
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
筛选与获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界中不存在的蛋白质
只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
考向一 基因工程的应用
10．红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是( )
A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
答案 C
解析 过程①构建基因表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；终止子的作用是终止转录过程，B错误；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；采用细胞培养生产EPO成本比较高，可以采用乳腺生物反应器，将基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物，D错误。
11．(2021·河北武邑中学模拟)我国科学家通过基因工程生产出了乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。通过基因工程技术生产乙肝疫苗的过程如下图所示。请回答下列问题：
(1)若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有________种，所需的酶是________________。
(2)进行②过程之前需构建基因表达载体，其中常用的载体是________。为提高②过程的转化效率，常采用的方法是_____________________________________________________。
(3)若将上述受体菌换成酵母菌，生产乙肝疫苗的效果会更好，从细胞结构的角度分析，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)乙肝病毒可以用于基因工程，可推知乙肝病毒属于________(填“DNA”或“RNA”)病毒。乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是_________________________________________。
答案 (1)2 Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) (2)质粒 用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌 (3)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对由核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理 (4)DNA 肝细胞表面有乙肝病毒的受体
解析 (1)PCR技术中，需要与两条模板链结合的2种不同的引物，使得耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)在构建基因表达载体的过程中，常用的载体是质粒。为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
12．(2018·天津，10)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
答案 (1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞
解析 (1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码的序列后，在翻译时终止密码提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。
(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。
(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。
(4)不具有侵染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。
考向二 蛋白质工程
13．某生物中发现一种基因的表达产物是具有较强抗菌性和溶血性的多肽P1，科研人员预期在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的蛋白质药物，下一步要做的是( )
A．合成编码多肽P1的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．设计抗菌性强但溶血性弱的蛋白质结构
D．利用抗原—抗体杂交的方法对表达产物进行检测
答案 C
14．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_____________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有改造________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的。中心法则的全部内容包括____________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期的蛋白质功能出发，通过______________________和______________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构) (2)P P1 DNA和RNA DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 功能
考点四 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)操作流程
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色( × )
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( √ )
(3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存( × )
(4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
(5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( × )
(源于选择性必修3 P74)下图为“DNA粗提取与鉴定”实验的相关操作，请根据图示分析其操作的目的是什么？
提示 ①析出DNA，除去溶于酒精的杂质；②使DNA溶解在2 mol·L－1NaCl溶液中。
考向一 DNA的粗提取与鉴定
15．(2020·江苏海安高级中学高三月考)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．植物材料需先研磨破碎细胞
C．DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
答案 B
解析 猪是哺乳动物，其成熟红细胞内没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，因此选用植物细胞提取DNA时，需先研磨破碎细胞，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高，C错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热后冷却，颜色应呈现蓝色，D错误。
16．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g，剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下、另一组置于－20 ℃条件下，分别保存24 h。
DNA的粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA的鉴定：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验的课题名称是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________________________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：________________________________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是________________________________________________________________________，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
答案 (1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)DNA断裂 (3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多 ②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢 (4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
解析 (1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为“探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量较多。(2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA断裂。(3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。(4)氯仿能使蛋白质变性沉淀，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。
17．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺试剂，混匀
加4 mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是__________________________，同时说明DNA对高温有较强的____________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 与A试管相比，B试管中含DNA丝状物，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，待试管冷却后，再比较两支试管中溶液颜色的变化。
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定
18．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR反应中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，以防污染，A正确；PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，B正确；PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以防污染，D正确。
19．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
解析 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
2．教材结论性语句
(1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(2)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，2种引物，4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(7)(选择性必修3 P93)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
(8)(选择性必修3 P94)对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D
解析 基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶(简称限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，B项错误；抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该链状DNA上一定至少有2个被酶切开的位置，D项正确。
3．(2020·天津，11)阅读下列材料，回答下题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一 人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二 小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三 疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是( )
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
答案 B
解析 资料一、二、三中的目的基因都是科学家从生物体内直接分离并克隆的，并非从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取，A项错误；资料一中，基因表达产物能有效控制虫害大规模爆发，资料二中，基因表达产物能避免小麦赤霉病大规模爆发，资料三中，基因表达产物可杀灭疟原虫，阻断疟疾的传播，说明上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B项正确；资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，受体细胞均是细菌，将目的基因导入微生物细胞常采用Ca2＋处理法；资料二中将抗赤霉病主效基因Fhb7导入小麦，小麦属于单子叶植物，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，因此将目的基因导入小麦细胞不可采用农杆菌转化法，而是采用基因枪法，基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，C项错误；在资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中防治害虫，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中杀灭疟原虫，两者均未直接导入防治对象中，D项错误。
4．(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________________________________________________________
____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了___________________，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)限制酶和DNA连接酶 转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3 品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
解析 (1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
5．(2020·天津，16)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。
据图回答：
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有______个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________(多选)。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽－重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是___________________________________________。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________(多选)。
A．B细胞 B．T细胞
C．巨噬细胞 D．浆细胞
答案 (1)6 (2)ABCD (3)3 (4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 (5)AB
解析 (1)据图分析，人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列改造后，第6、15、16、18、21、24、30位的核苷酸与改造前不同，则转录产生的密码子中第2、5、6、7、8、10个密码子发生了碱基的替换。(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，以确保等比例表达A、B肽链。若引入的短肽编码序列含有终止子序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止转录过程，引起构成胰岛素的肽链变短；若引入的短肽编码序列含有终止密码子编码序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止翻译过程，引起构成胰岛素的肽链变短；引入的短肽编码序列应当位于A链和B链之间，不能改变A、B链的氨基酸序列，也不能改变原人胰岛素抗原性，新产生的胰岛素具备原有的抗原性才能在被小肠黏膜吸收后，诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状，因此A、B、C、D四个选项均正确。(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶的酶切位点共有3个，则用这两种限制酶充分酶切后，能够将环状的重组表达载体切成3种不同长度的链状DNA片段。(4)该信号肽－重组人胰岛素是在乳酸菌的核糖体上合成的，分布在细胞壁上，则其合成和运输过程是在核糖体上合成，经过细胞质基质、细胞膜运输，最后到达细胞壁。(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现的人胰岛素抗原会引起小鼠机体发生特异性免疫反应，该过程中能够特异性识别抗原的细胞包括B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞和记忆细胞，巨噬细胞对抗原的识别不具有特异性，浆细胞不能识别抗原。
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1．(2020·河北易县中学高三月考)现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性内切核酸酶酶切后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。下列相关叙述正确的是( )
A．酶H有2个识别位点和切割位点
B．酶B和酶H同时切割时，有3个识别位点和切割位点
C．酶B和酶H同时切割时，能产生完全相同的酶切片段
D．酶B和酶H有相同的识别位点和切割位点
答案 B
解析 由图1和该线性DNA分子的长度可知，酶H单独切割，能产生两个DNA片段，说明酶H有1个识别位点和切割位点，A错误；根据图3和该线性DNA分子的长度可知，用酶B和酶H同时切割，能产生四个DNA片段，即1个1 400 bp、2个600 bp和1个400 bp的片段，说明两种酶同时使用时，有3个识别位点和切割位点，B正确；酶B和酶H同时切割时，能产生长度相同的酶切片段，但是碱基序列是否相同不能确定，C错误；根据题图和该线性DNA分子的长度分析可知，酶H有1个识别位点和切割位点，酶B有2个识别位点和切割位点，两种酶同时使用时，有3个识别位点和切割位点，说明酶B和酶H没有相同的识别位点和切割位点，D错误。
2．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( )
A．图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案 C
解析 为防止酶切后目的基因和质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶，即PstⅠ和EcoRⅠ，A正确；抗卡那霉素基因作为标记基因，作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因内部，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，C错误；基因表达载体包括目的基因(抗原基因)、标记基因(抗卡那霉素基因)、启动子和终止子等，D正确。
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度
B．设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案 D
解析 PCR过程中，变性温度需要达到90 ℃以上，复性需将温度下降到50 ℃左右，延伸需将温度上升到72 ℃左右，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度，A正确；设计引物时，需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连，B正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，高温条件下，DNA变性，解聚为单链，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条单链DNA结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16(个)DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子中一个含有引物A，另一个含有引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
4．荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是( )
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA(部分基因文库)作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
答案 D
解析 引物与探针的本质都是核苷酸序列，二者均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B正确；由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，能反映细胞转录的基因种类和水平，所以若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；由题图可知，Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，D错误。
5．动物生物反应器的研究开发重点是动物血液反应器和动物乳腺反应器，即把人体相关基因整合到动物胚胎里，使生出的转基因动物血液中或长大后产生的乳汁中含有人类所需要的药用蛋白质。以下相关说法错误的是( )
A．在制备乳腺生物反应器时需将目的基因导入受精卵中
B．将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建表达载体
C．实验过程中采用显微注射的方法导入目的基因
D．获得的转基因动物只有乳腺细胞内具有目的基因
答案 D
解析 转基因动物的所有细胞中都含有目的基因，只是在乳腺细胞中表达，D错误。
6．(2021·海南海口高三模拟)科研人员利用相关技术改变了胰岛素B链第29位氨基酸，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述不正确的是( )
A．胰岛素的本质是蛋白质，不宜口服使用
B．可通过测定DNA的序列确定突变是否成功
C．对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程
D．该过程的操作对象是胰岛素分子
答案 D
解析 胰岛素的本质是蛋白质，只能注射，不宜口服使用，A正确；基因突变是指DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，因此可通过测定DNA的序列确定突变是否成功，B正确；根据蛋白质工程的概念可知，对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程，C正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，蛋白质工程的操作对象是基因，D错误。
7．目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT－PCR技术。RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B
B．引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸
C．过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
D．该反应体系中应加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质
答案 A
解析 通过图示可知，与该mRNA结合的引物是A引物，A错误；引物A与引物B是一段DNA序列，其基本单位都是脱氧核苷酸，B正确；过程Ⅱ为PCR的反应阶段，通过控制温度的变化实现变性、复性、延伸，实现目标序列的循环扩增，C正确；RT－PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、四种脱氧核糖核苷酸、逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质，D正确。
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
8．(2021·山东枣庄三中模拟)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述正确的是( )
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500
1 900；200；800；600；1 000；500
A．a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 ABD
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出，a酶和b酶切割后产生的黏性末端互补，它们之间能相互连接，B正确；由表格可以看出，b酶把大小为2 100 bp的DNA片段切成大小分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把大小为1 400 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切割位点，因此仅用b酶切割，可得到3个DNA分子产物，C错误；限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子，D正确。
9．利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n次，下列有关该过程的相关说法正确的是( )
A．测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对
B．共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成
C．向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
D．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
答案 AB
解析 利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A正确；DNA分子复制方式为半保留复制，扩增n次后，有(2n－2)个DNA分子是重新合成的，且每个DNA分子含1对引物，而含最初模板链的2个DNA分子中含有1对引物，因此扩增n次后共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；PCR技术中DNA双链解开不需要解旋酶，且利用PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增的过程一般为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中不需要保持恒温，D错误。
三、非选择题
10．(2020·江苏苏锡常镇高三一模)CTAB法是一种提取植物DNA的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，能与核酸形成复合物，在高盐(>0.7 mol/L NaCl)浓度下可溶，在低盐(0.1～0.5 mol/L NaCl)浓度下，复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质等杂质后，加入异丙醇获得的沉淀物为CTAB与核酸复合物，用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB。请回答下列问题：
(1)CTAB提取液中，NaCl浓度为1.4 mol/L的目的是________________________。步骤④中用体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀物的目的是去除________。
(2)用体积分数为75%的乙醇洗涤后的沉淀物中含有RNA，为得到较为纯净的DNA，可先用__________溶液溶解，然后加入________酶，然后再重复步骤________，最后在上清液中加入一定体积的、冷却的________________________，可以得到较纯净的DNA。
答案 (1)溶解CTAB与核酸复合物 CTAB (2)2 mol/L的NaCl RNA ② 体积分数为95%的乙醇
解析 (1)根据题干信息“CTAB能与核酸形成复合物，在高盐(>0.7 mol/L NaCl)浓度下可溶”可知，NaCl浓度为1.4 mol/L的目的是溶解CTAB与核酸复合物。根据题干信息“用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB”可知，步骤④中用体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀物的目的是去除CTAB。(2)由于DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，所以为了得到较为纯净的DNA，可以先用2 mol/L的NaCl溶液溶解，然后加入RNA酶，将RNA水解，重复步骤②，由于DNA分子不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，所以最后在上清液中加入一定体积的、冷却的体积分数为95%的乙醇，可以得到较纯净的DNA。
11．研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。
(1)原癌基因的作用是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白(抗原)时，应构建胞外区基因，转入原核细胞表达并提纯。选择胞外区的原因是_________________________。为了扩增出大量胞外区需要用到PCR技术。常规PCR技术一般包括变性、复性、延伸等步骤，复性的目的是____________________________________。设计引物是PCR技术的关键步骤之一，某同学设计的两组引物如下表所示。______________(填“引物对A”或“引物对B”)设计不合理，并说出不合理的理由：______________________________________________
________________________________________________________________________。
引物对A
P1 AAGCCGGGCGCGCCCGGAA
P2 TTCGGCCCGCGTTATGCGCG
引物对B
S1 GTCCGCTAGTGGCTGTG
S2 AGCTGGCGTTTAGCCTCG
(3)制备抗H蛋白单克隆抗体时，需将H蛋白注射到小鼠体内。这样做的目的是________________________________。制备抗H蛋白单克隆抗体时，需要用到细胞融合技术，该技术的主要优点是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)治疗乳腺癌时，方法之一是单独使用抗H蛋白单克隆抗体，试写出治疗乳腺癌的另一种疗效高、毒副作用小、不损伤正常细胞的方法：______________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程 (2)由于抗体主要存在于细胞外液中，制备获得的抗体作用于该抗原的胞外区 引物与模板发生碱基互补配对 引物对A 引物P1自身碱基互补配对，引物P1和P2部分发生碱基互补配对 (3)使小鼠体内产生相应的B淋巴细胞 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 (4)将该单克隆抗体与抗癌药物结合构建“生物导弹”，注入体内，杀死癌细胞
12．如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：
(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择________________________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上__________________________，这样设计的优点是________________________________________________________________________。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用__________________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________________。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入__________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用__________方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
答案 (1)SnaBⅠ和AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接(或避免质粒和目的基因自身环化及反向连接) (2)DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4)卡拉霉素 PCR (5)甲醇
解析 (1)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ、SacⅠ 4种限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶的识别序列。这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。(2)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(3)步骤3是要获取含有5′AOX1－3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(4)5′AOX1－3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。检测目的基因是否转录应该用PCR技术。(5)巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
第39讲 基因工程
[目标要求] 1.阐明重组DNA技术所需三种工具的作用。2.概述“DNA的粗提取与鉴定”实验的原理与方法。3.阐明基因工程的基本操作程序及方法。4.举例说明基因工程的应用。5.概述蛋白质工程的原理及步骤。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2．基本工具
(1)限制性内切核酸酶
特别提醒 将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
教材中的隐性知识 源于选择性必修3 P71“旁栏思考”
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
②类型
常用类型
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
教材中的隐性知识 源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( × )
(2)限制酶只能用于切割目的基因( × )
(3)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(4)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( × )
(5)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(6)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因( × )
(1)不同种生物的基因能拼接的理论基础是：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)外源基因在受体细胞内能表达的理论基础是：①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界共用一套遗传密码。
1．与DNA有关的酶的比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
考向一 基因工程工具酶的应用
1．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是( )
A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
答案 A
2．某质粒载体的结构如图所示。现有BamHⅠ、MboⅠ、PalⅠ三种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、↓GATC、GG↓CC。已知目的基因的两端均有后两种限制酶的识别序列。回答下列问题：
(1)从表达载体的组成上看，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因属于______________。通常该结构必须具备的特性有：表达产物对细胞无害、表达产物及产物的功能便于检测、表达产物及产物的功能在受体细胞中本身________(填“不存在”或“已存在”)。
(2)上述三种限制酶中，能切割产生平末端的酶是________，能切割产生相同黏性末端的酶是________________________________________________________________________。
(3)若将质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，应选用的限制酶是______________(填“MboⅠ”或“PalⅠ”)。不选用另一种酶的原因是______________
________________________________________________________________________。
答案 (1)标记基因 不存在 (2)PalⅠ BamHⅠ、MboⅠ (3)PalⅠ 若用MboⅠ处理会破坏质粒中的两个标记基因，不利于重组DNA分子的筛选
考向二 基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细菌拟核DNA之外的细胞质中
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案 C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案 D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二 基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①根据已知结构和功能进行筛选。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取
①构建基因文库获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用
(3)构建过程
3．将目的基因导入受体细胞
生物
种类
植物
动物
微生物
常用
方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体
细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
RCR
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
如抗虫、抗病的接种实验
(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因( × )
(2)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( √ )
(3)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( √ )
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达( √ )
(5)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达( × )
据图回答问题：
构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子及标记基因等。图中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
1．PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程
关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较
2．基因表达载体构建过程
如果用同一种限制酶切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
考向一 目的基因的获取
5．(2020·中国人民大学附中高三摸底)在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是( )
A．引物1与引物2 B．引物3与引物4
C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
答案 C
解析 要获得B链，则需要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
6．下列关于利用PCR技术扩增目的基因的叙述，正确的是( )
A．PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使核糖核苷酸序列呈指数形式增加
B．在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种双链引物
C．目的基因的扩增依赖于模板、耐高温的DNA聚合酶和原料等物质
D．加热至90 ℃以上的目的是使目的基因的磷酸二酯键断裂
答案 C
解析 PCR技术利用DNA半保留复制的原理，使脱氧核苷酸序列呈指数形式增加，A错误；在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因的碱基序列互补的两种单链引物，B错误；PCR过程中，每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步，在扩增过程中需依赖目的基因为模板、耐高温的DNA聚合酶和相应原料(脱氧核糖核苷酸)等物质，C正确；加热至90 ℃以上的目的是使目的基因的两条链断开，因此高温破坏的是两条链间的氢键，D错误。
考向二 基因工程的基本操作程序
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物细胞的基因组中。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体DNA上
答案 D
解析 目的基因应插入T－DNA片段上，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞；若受体细胞为原核生物，常采用Ca2＋处理，使原核细胞成为感受态细胞；Ti质粒分布在细菌拟核DNA之外。
8．(2017·全国Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了______________________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是___________________________________。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案 (1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 四种游离的脱氧核苷酸 (3)①进行细胞传代培养 维持培养箱中的pH ②C
解析 (1)因为编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子，因此所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)PCR技术扩增目的基因的条件需要：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶。序列甲作为模板DNA，DNA的原料为四种游离的脱氧核苷酸。
(3)①动物细胞可以通过细胞培养(传代培养)继续增殖。细胞培养过程中，需要气体环境，其中气体CO2的作用是维持培养箱中的pH。②分析坐标图：对比甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况发现：最终效果相当，只是增殖时间不同，可以推断出A、E片段编码的肽段不会降低T淋巴细胞增殖效果。将丙蛋白分别与甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况比较发现：丙蛋白降低了T淋巴细胞增殖。丙序列与甲和乙序列相比较，缺少了C片段，也就是说若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
9．据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病。这种技术把选定的X基因导入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素。请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为__________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、____________、4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用____________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)目的基因 引物 模板DNA (2)基因表达载体的构建 质粒 DNA连接酶 (3)PCR 实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程
1．基因工程的应用
表现方面
具体内容
在农牧业方面的应用
①转基因抗虫植物；②转基因抗病植物；③转基因抗除草剂植物；④改良植物的品质；⑤提高动物的生长速率；⑥改善畜产品的品质
在医药卫生领域的应用
①对微生物或动植物的细胞进行基因改造来生产药物；②利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物；③用转基因动物作器官移植供体
在食品工业方面的应用
利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等
特别提醒 (1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：改造或合成基因。
③结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
(3)蛋白质工程的应用
①利用蛋白质工程研发药物。
②利用蛋白质工程改进或开发新的工业酶。
③在农业方面，改造光合作用相关的酶。
(1)转基因抗病农作物不需要使用农药( × )
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质( √ )
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质( √ )
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
(源于选择性必修3 P91“正文”)利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
1．乳腺生物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子。
(3)受体细胞：哺乳动物的受精卵。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3．蛋白质工程与基因工程的异同
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
筛选与获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界中不存在的蛋白质
只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程
考向一 基因工程的应用
10．红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是( )
A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
答案 C
解析 过程①构建基因表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；终止子的作用是终止转录过程，B错误；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；采用细胞培养生产EPO成本比较高，可以采用乳腺生物反应器，将基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物，D错误。
11．(2021·河北武邑中学模拟)我国科学家通过基因工程生产出了乙型肝炎病毒疫苗，为预防乙肝提供了有力的保障。通过基因工程技术生产乙肝疫苗的过程如下图所示。请回答下列问题：
(1)若要获得大量的目的基因，可采用PCR技术进行体外扩增，该技术中使用的引物有________种，所需的酶是________________。
(2)进行②过程之前需构建基因表达载体，其中常用的载体是________。为提高②过程的转化效率，常采用的方法是_____________________________________________________。
(3)若将上述受体菌换成酵母菌，生产乙肝疫苗的效果会更好，从细胞结构的角度分析，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)乙肝病毒可以用于基因工程，可推知乙肝病毒属于________(填“DNA”或“RNA”)病毒。乙肝病毒专一侵染肝细胞的原因是_________________________________________。
答案 (1)2 Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) (2)质粒 用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌 (3)酵母菌具有内质网、高尔基体，可以对由核糖体合成的肽链进行剪切、折叠、加工、修饰等处理 (4)DNA 肝细胞表面有乙肝病毒的受体
解析 (1)PCR技术中，需要与两条模板链结合的2种不同的引物，使得耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)在构建基因表达载体的过程中，常用的载体是质粒。为了提高将重组质粒导入细菌的转化效率，常用Ca2＋(CaCl2)溶液处理细菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
12．(2018·天津，10)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加______________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
答案 (1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D (4)细胞
解析 (1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码的序列后，在翻译时终止密码提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。
(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。
(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。
(4)不具有侵染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。
考向二 蛋白质工程
13．某生物中发现一种基因的表达产物是具有较强抗菌性和溶血性的多肽P1，科研人员预期在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的蛋白质药物，下一步要做的是( )
A．合成编码多肽P1的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．设计抗菌性强但溶血性弱的蛋白质结构
D．利用抗原—抗体杂交的方法对表达产物进行检测
答案 C
14．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_____________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有改造________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的。中心法则的全部内容包括____________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期的蛋白质功能出发，通过______________________和______________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构) (2)P P1 DNA和RNA DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 功能
考点四 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)操作流程
2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300_nm的紫外灯下被检测出来。
注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色( × )
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( √ )
(3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存( × )
(4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( × )
(5)为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换( × )
(源于选择性必修3 P74)下图为“DNA粗提取与鉴定”实验的相关操作，请根据图示分析其操作的目的是什么？
提示 ①析出DNA，除去溶于酒精的杂质；②使DNA溶解在2 mol·L－1NaCl溶液中。
考向一 DNA的粗提取与鉴定
15．(2020·江苏海安高级中学高三月考)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．植物材料需先研磨破碎细胞
C．DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
答案 B
解析 猪是哺乳动物，其成熟红细胞内没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物细胞含有细胞壁，因此选用植物细胞提取DNA时，需先研磨破碎细胞，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高，C错误；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热后冷却，颜色应呈现蓝色，D错误。
16．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g，剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下、另一组置于－20 ℃条件下，分别保存24 h。
DNA的粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA的鉴定：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验的课题名称是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________________________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：________________________________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：__________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是________________________________________________________________________，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
答案 (1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)DNA断裂 (3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多 ②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢 (4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
解析 (1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为“探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量较多。(2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA断裂。(3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。(4)氯仿能使蛋白质变性沉淀，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。
17．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺试剂，混匀
加4 mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是__________________________，同时说明DNA对高温有较强的____________。
(4)A试管在实验中的作用是____________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 与A试管相比，B试管中含DNA丝状物，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，待试管冷却后，再比较两支试管中溶液颜色的变化。
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定
18．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR反应中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理，以防污染，A正确；PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，B正确；PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误；在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，以防污染，D正确。
19．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
解析 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
1．核心概念
(1)(选择性必修3 P67)基因工程：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选择性必修3 P72)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(3)(选择性必修3 P76)目的基因：指在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(4)(选择性必修3 P81)转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选择性必修3 P84)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
2．教材结论性语句
(1)(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(2)(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(3)(选择性必修3 P74)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(4)(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板，2种引物，4种脱氧核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
(5)(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有启动子、终止子等。
(6)(选择性必修3 P84)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(7)(选择性必修3 P93)基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。
(8)(选择性必修3 P94)对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
解析 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
2．(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D
解析 基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶(简称限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，B项错误；抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该链状DNA上一定至少有2个被酶切开的位置，D项正确。
3．(2020·天津，11)阅读下列材料，回答下题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一 人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二 小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三 疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是( )
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
答案 B
解析 资料一、二、三中的目的基因都是科学家从生物体内直接分离并克隆的，并非从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取，A项错误；资料一中，基因表达产物能有效控制虫害大规模爆发，资料二中，基因表达产物能避免小麦赤霉病大规模爆发，资料三中，基因表达产物可杀灭疟原虫，阻断疟疾的传播，说明上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B项正确；资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，受体细胞均是细菌，将目的基因导入微生物细胞常采用Ca2＋处理法；资料二中将抗赤霉病主效基因Fhb7导入小麦，小麦属于单子叶植物，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，因此将目的基因导入小麦细胞不可采用农杆菌转化法，而是采用基因枪法，基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，C项错误；在资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中防治害虫，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中杀灭疟原虫，两者均未直接导入防治对象中，D项错误。
4．(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________________________________________________________
____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了___________________，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)限制酶和DNA连接酶 转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3 品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
解析 (1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
5．(2020·天津，16)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。
据图回答：
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有______个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是________(多选)。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽－重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是___________________________________________。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有________(多选)。
A．B细胞 B．T细胞
C．巨噬细胞 D．浆细胞
答案 (1)6 (2)ABCD (3)3 (4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 (5)AB
解析 (1)据图分析，人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列改造后，第6、15、16、18、21、24、30位的核苷酸与改造前不同，则转录产生的密码子中第2、5、6、7、8、10个密码子发生了碱基的替换。(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，以确保等比例表达A、B肽链。若引入的短肽编码序列含有终止子序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止转录过程，引起构成胰岛素的肽链变短；若引入的短肽编码序列含有终止密码子编码序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止翻译过程，引起构成胰岛素的肽链变短；引入的短肽编码序列应当位于A链和B链之间，不能改变A、B链的氨基酸序列，也不能改变原人胰岛素抗原性，新产生的胰岛素具备原有的抗原性才能在被小肠黏膜吸收后，诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状，因此A、B、C、D四个选项均正确。(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶的酶切位点共有3个，则用这两种限制酶充分酶切后，能够将环状的重组表达载体切成3种不同长度的链状DNA片段。(4)该信号肽－重组人胰岛素是在乳酸菌的核糖体上合成的，分布在细胞壁上，则其合成和运输过程是在核糖体上合成，经过细胞质基质、细胞膜运输，最后到达细胞壁。(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现的人胰岛素抗原会引起小鼠机体发生特异性免疫反应，该过程中能够特异性识别抗原的细胞包括B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞和记忆细胞，巨噬细胞对抗原的识别不具有特异性，浆细胞不能识别抗原。
课时精练
一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。
1．(2020·河北易县中学高三月考)现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性内切核酸酶酶切后进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1；用酶B单独酶切，结果如图2；用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。下列相关叙述正确的是( )
A．酶H有2个识别位点和切割位点
B．酶B和酶H同时切割时，有3个识别位点和切割位点
C．酶B和酶H同时切割时，能产生完全相同的酶切片段
D．酶B和酶H有相同的识别位点和切割位点
答案 B
解析 由图1和该线性DNA分子的长度可知，酶H单独切割，能产生两个DNA片段，说明酶H有1个识别位点和切割位点，A错误；根据图3和该线性DNA分子的长度可知，用酶B和酶H同时切割，能产生四个DNA片段，即1个1 400 bp、2个600 bp和1个400 bp的片段，说明两种酶同时使用时，有3个识别位点和切割位点，B正确；酶B和酶H同时切割时，能产生长度相同的酶切片段，但是碱基序列是否相同不能确定，C错误；根据题图和该线性DNA分子的长度分析可知，酶H有1个识别位点和切割位点，酶B有2个识别位点和切割位点，两种酶同时使用时，有3个识别位点和切割位点，说明酶B和酶H没有相同的识别位点和切割位点，D错误。
2．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( )
A．图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶
B．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
C．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案 C
解析 为防止酶切后目的基因和质粒自身连接成环状，图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶，即PstⅠ和EcoRⅠ，A正确；抗卡那霉素基因作为标记基因，作用是筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因内部，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，C错误；基因表达载体包括目的基因(抗原基因)、标记基因(抗卡那霉素基因)、启动子和终止子等，D正确。
3．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是( )
A．延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度
B．设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连
C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案 D
解析 PCR过程中，变性温度需要达到90 ℃以上，复性需将温度下降到50 ℃左右，延伸需将温度上升到72 ℃左右，因此延伸的温度要大于复性温度而小于变性温度，A正确；设计引物时，需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连，B正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，高温条件下，DNA变性，解聚为单链，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条单链DNA结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16(个)DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子中一个含有引物A，另一个含有引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
4．荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列相关叙述错误的是( )
A．引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关
C．若用cDNA(部分基因文库)作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平
D．Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸
答案 D
解析 引物与探针的本质都是核苷酸序列，二者均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B正确；由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，能反映细胞转录的基因种类和水平，所以若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；由题图可知，Taq DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，D错误。
5．动物生物反应器的研究开发重点是动物血液反应器和动物乳腺反应器，即把人体相关基因整合到动物胚胎里，使生出的转基因动物血液中或长大后产生的乳汁中含有人类所需要的药用蛋白质。以下相关说法错误的是( )
A．在制备乳腺生物反应器时需将目的基因导入受精卵中
B．将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等结合在一起构建表达载体
C．实验过程中采用显微注射的方法导入目的基因
D．获得的转基因动物只有乳腺细胞内具有目的基因
答案 D
解析 转基因动物的所有细胞中都含有目的基因，只是在乳腺细胞中表达，D错误。
6．(2021·海南海口高三模拟)科研人员利用相关技术改变了胰岛素B链第29位氨基酸，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述不正确的是( )
A．胰岛素的本质是蛋白质，不宜口服使用
B．可通过测定DNA的序列确定突变是否成功
C．对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程
D．该过程的操作对象是胰岛素分子
答案 D
解析 胰岛素的本质是蛋白质，只能注射，不宜口服使用，A正确；基因突变是指DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，因此可通过测定DNA的序列确定突变是否成功，B正确；根据蛋白质工程的概念可知，对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程，C正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，蛋白质工程的操作对象是基因，D错误。
7．目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT－PCR技术。RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，具体过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．与该mRNA结合的引物，可以是A也可以是B
B．引物A与引物B的基本单位都是脱氧核苷酸
C．过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
D．该反应体系中应加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质
答案 A
解析 通过图示可知，与该mRNA结合的引物是A引物，A错误；引物A与引物B是一段DNA序列，其基本单位都是脱氧核苷酸，B正确；过程Ⅱ为PCR的反应阶段，通过控制温度的变化实现变性、复性、延伸，实现目标序列的循环扩增，C正确；RT－PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、四种脱氧核糖核苷酸、逆转录酶、TaqDNA聚合酶等物质，D正确。
二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。
8．(2021·山东枣庄三中模拟)某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述正确的是( )
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500
1 900；200；800；600；1 000；500
A．a酶与b酶切断的化学键相同
B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接
C．仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物
D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
答案 ABD
解析 限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出，a酶和b酶切割后产生的黏性末端互补，它们之间能相互连接，B正确；由表格可以看出，b酶把大小为2 100 bp的DNA片段切成大小分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把大小为1 400 bp的DNA片段切成大小分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切割位点，因此仅用b酶切割，可得到3个DNA分子产物，C错误；限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子，D正确。
9．利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n次，下列有关该过程的相关说法正确的是( )
A．测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对
B．共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成
C．向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等
D．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
答案 AB
解析 利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A正确；DNA分子复制方式为半保留复制，扩增n次后，有(2n－2)个DNA分子是重新合成的，且每个DNA分子含1对引物，而含最初模板链的2个DNA分子中含有1对引物，因此扩增n次后共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，B正确；PCR技术中DNA双链解开不需要解旋酶，且利用PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增的过程一般为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中不需要保持恒温，D错误。
三、非选择题
10．(2020·江苏苏锡常镇高三一模)CTAB法是一种提取植物DNA的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，能与核酸形成复合物，在高盐(>0.7 mol/L NaCl)浓度下可溶，在低盐(0.1～0.5 mol/L NaCl)浓度下，复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提，去除蛋白质等杂质后，加入异丙醇获得的沉淀物为CTAB与核酸复合物，用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB。请回答下列问题：
(1)CTAB提取液中，NaCl浓度为1.4 mol/L的目的是________________________。步骤④中用体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀物的目的是去除________。
(2)用体积分数为75%的乙醇洗涤后的沉淀物中含有RNA，为得到较为纯净的DNA，可先用__________溶液溶解，然后加入________酶，然后再重复步骤________，最后在上清液中加入一定体积的、冷却的________________________，可以得到较纯净的DNA。
答案 (1)溶解CTAB与核酸复合物 CTAB (2)2 mol/L的NaCl RNA ② 体积分数为95%的乙醇
解析 (1)根据题干信息“CTAB能与核酸形成复合物，在高盐(>0.7 mol/L NaCl)浓度下可溶”可知，NaCl浓度为1.4 mol/L的目的是溶解CTAB与核酸复合物。根据题干信息“用体积分数为75%的乙醇洗涤可去除CTAB”可知，步骤④中用体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀物的目的是去除CTAB。(2)由于DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，所以为了得到较为纯净的DNA，可以先用2 mol/L的NaCl溶液溶解，然后加入RNA酶，将RNA水解，重复步骤②，由于DNA分子不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，所以最后在上清液中加入一定体积的、冷却的体积分数为95%的乙醇，可以得到较纯净的DNA。
11．研究表明，HER2/neu是一种原癌基因，它表达的H蛋白在多种恶性肿瘤特别是乳腺癌细胞中过量表达。抗H蛋白单克隆抗体能抑制过量表达H蛋白的乳腺癌细胞的生长，目前已成为有效的生物治疗手段。
(1)原癌基因的作用是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)H蛋白是一个跨膜蛋白，结构如图所示。制备免疫小鼠用的H蛋白(抗原)时，应构建胞外区基因，转入原核细胞表达并提纯。选择胞外区的原因是_________________________。为了扩增出大量胞外区需要用到PCR技术。常规PCR技术一般包括变性、复性、延伸等步骤，复性的目的是____________________________________。设计引物是PCR技术的关键步骤之一，某同学设计的两组引物如下表所示。______________(填“引物对A”或“引物对B”)设计不合理，并说出不合理的理由：______________________________________________
________________________________________________________________________。
引物对A
P1 AAGCCGGGCGCGCCCGGAA
P2 TTCGGCCCGCGTTATGCGCG
引物对B
S1 GTCCGCTAGTGGCTGTG
S2 AGCTGGCGTTTAGCCTCG
(3)制备抗H蛋白单克隆抗体时，需将H蛋白注射到小鼠体内。这样做的目的是________________________________。制备抗H蛋白单克隆抗体时，需要用到细胞融合技术，该技术的主要优点是______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)治疗乳腺癌时，方法之一是单独使用抗H蛋白单克隆抗体，试写出治疗乳腺癌的另一种疗效高、毒副作用小、不损伤正常细胞的方法：______________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程 (2)由于抗体主要存在于细胞外液中，制备获得的抗体作用于该抗原的胞外区 引物与模板发生碱基互补配对 引物对A 引物P1自身碱基互补配对，引物P1和P2部分发生碱基互补配对 (3)使小鼠体内产生相应的B淋巴细胞 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 (4)将该单克隆抗体与抗癌药物结合构建“生物导弹”，注入体内，杀死癌细胞
12．如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：
(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择________________________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上__________________________，这样设计的优点是________________________________________________________________________。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用__________________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________________。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入__________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用__________方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
答案 (1)SnaBⅠ和AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接(或避免质粒和目的基因自身环化及反向连接) (2)DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4)卡拉霉素 PCR (5)甲醇
解析 (1)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ、SacⅠ 4种限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶的识别序列。这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。(2)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(3)步骤3是要获取含有5′AOX1－3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(4)5′AOX1－3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。检测目的基因是否转录应该用PCR技术。(5)巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
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